Bioinformatics, Протоколы, Протеин Proteomics RNA ДНАА

домашн > протеин > устранять неисправность-западн-troubleshooting-western-blots > index.php

Устраняя неисправность Западные Помарки

  Молекулярный направляющий выступ станции к западным blotting проблемам и разрешениям: Общие западные проблемы и разрешения помаркой для их!

Пожалуйста свяжитесь мы с вашими идеями если вы можете добавить к этому направляющему выступу.

 

Будет вашей западной проблемой помаркой? - Организовано Алфавитно

Пушистые Полосы

Низкий Сигнал

Мембрана накаляет в темной комнате

Высокая Предпосылка

Пятна на пленке

Too many полос в западной помарке

Слабый Сигнал

 

 

Устраняя неисправность Западная Проблема Помарками:

Пятна на пленке (пропуская полосах) :

- переход бедных должный к воздушным пузырекам во время перехода к мембране

- пакостная пленка добавляя к проявителю

- крены проявителя пакостны

Разрешение к пятнам на пленке:

- используйте пипетку pasteur как крен ролика мембрана и gel перед переходом для того чтобы извлечь мембрану и материалы содержания пузырей влажные.

- держите пленку чистым перед добавлять к проявителю

 

Устраняя неисправность Западная Проблема Помарками:

Too many полос в западной помарке:

- обычно должно к много неспецифичных полос

- плохое главным образом качество антитела или старое антитело

- достаточно преграждающ

- протеолитическое расщепление антигена - все дополнительные полосы будут более низким mw чем ваш протеин, (обнаруживается но был ухудшен ie ваш протеин)

Разрешения к too many полос на западной помарке:

- закупите другое антитело или замените с свежим штоком антитела

- блок с молоком 5% сухим non-fat или BSA перед добавлять главным образом. Если вы уже преграждаете, то рассматривайте преградить во время первичных и вторичных инкубаций антитела и также увеличить преграждающ молоко или концентрацию BSA.

- держите все на льде, используйте свежие образцы, храньте внутри - 80C, и используйте иы АБС битор протеазы such as PMSF

 

Устраняя неисправность Западная Проблема Помарками:

Высокая предпосылка; низкий коэффициент signal to noise на западной помарке

- чернота или каждая темная пленка; пленка подверглась действию слишком длиной

- преграждать был недостаточн; неспецифичная вязка первичного антитела и вторичные антитела не были помыты вполне

- запиток был недостаточн

- пленка накаляет в темноте! - слишком высокие вторичные или главным образом разбавления

Разрешения к темной пленке:

- публично разоблачение на меньше время, выдержка уменшения

- увеличьте преграждать продолжительность non-fat сухой инкубации молока 5% или увеличьте концентрацию.

- также вы можете попытаться преградить с всей сывороткой животного хозяина с (или раньше) вторичным антителом

- увеличьте моя времена и тома к помощи извлекают любой неспецифичный сигнал должный к слабой вязке антитела.

- использование более сильного тензида помыть - вместо TBST (Tween-20), использовать более сильные тензиды such as NP-40 или sds которое могут обеспечить более stringent мытье и уменьшить предпосылку (делает это только если вы соединяете, то сильно! - мыть также извлекает некоторую вашу полосу интереса!)

- очень высокая вторичная концентрация антитела (or even главным образом) - выполните эксперименты по оптимизирования для того чтобы обусловить правильные разбавления антитела разбавьте антитела более далее.

 

Устраняя неисправность Западная Проблема Помарками:

Низкий сигнал или слабый сигнал

- должно к не достаточному протеину нагрузил на геле

- главным образом антитело старо или хорошо

- фосфоропротеиды обычно ночная главным образом инкубация антитела

- не достаточное вторичное антитело

- над-pregrajdah5

- превращаясь реагенты будут плох/они совершили ошибка подготовляя их

Разрешения к низкому сигналу или слабому сигналу:

- нагрузите больше образца протеина на гель

- антитело попытки свежее главным образом

- инкубируйте главным образом overnite антитела для фосфоропротеидов на 4 градусах ч (трасучки холодной комнаты)

- увеличьте концентрацию протеина (лизируйте образцы в меньше буфере lysis)

- уменьшейте концентрацию преграждая вещества

- проверите превращаясь реагенты; подготовьте свежий ecl и re-ECL мембрана

- увеличьте концентрацию или длину главным образом периода инкубации антитела

- увеличьте концентрацию или длину вторичного периода инкубации антитела

 

Пушистые полосы, смазанные полосы, полосы острые

- должное смазанное полосами к горячему гелю

- должное полос пушистое к высокому напряжению

Разрешения к пушистым полосам и un-sharp полосам:

- уменьшейте напряжение тока или в настоящее время, побегите в холодной комнате, и подготовьте новый идущий буфер (жара причиняет гель потерять свою ригидность и свою разрешая силу)

- пре-vyderjite мембрану перехода в соотвествующем разрешении перехода (обусловленном изготовлением мембраны) для требуемого отрезока времени.