Bioinformatics, Протоколы, Протеин Proteomics RNA ДНАА

Протоколы Bioinformatic Биологии Домашние Оборудуют Encyclopaedia Биологии Форумов Биологии Молекулярный Молекулярные Изображения Биологии, котор Bookmark Мы!

домашн > протеин > протеин-protokoly > западн-western-blotting > index.php

Исследование Proteomics Протеина RNA ДНАА Videos Науки Новостиа науки Молекулярной Биологии Домашнее БЕТА! Методов биологии оборудования лаборатории Bioinformatics продукты биологии молекулярных молекулярные и соединения биологии обслуживаний родственные

Молекулярная Биология Blog

Пошлите эту страницу к другу

Внутриклеточные Станции

Буферов буферов ботаники антитела обломоки PCR в реальном масштабе времени PCR RNAi Microarray протеина Proteomics пептида воображения микробиологии массового спектрометрирования иммунологии Microarrays гистологии биологии клетки bookstore общих алфавитные и электрофореза геля культуры молекулярные и помарка Transfection биологии стержневой клетки SiRNA западная

Западная Помарка

 

Западные Протоколы Помаркой

Западный Форум Помаркой

Западные Продукты Помаркой

Западные Книги Помаркой

Западный Устранять неисправность Помарки

Западные Книги Помаркой

 

Западный Blotting Протокол

Западн-western-blot протокол

Подготовка образцов для электрофореза геля SDS-PAGE от подготовленной клетки Lysates

1. Подготовьте гели для SDS-PAGE
2. Подготовьте буфер 1X идущий
3. Добавьте 50 mL бета-merkapto3tanola к буферу образца 950 ml (для 1 mL). (только если вы пре-ne добавляли бета-merkapto3tanol к буферу образца)
4. Добавьте буфер образца к каждому образцу (pre-determine how much образца вы можете нагрузить в добро - гребни BioRad тонко могут сохранить о 30uL. Большие гребни консервируют accomate до 50uL).
5. Образцы вортекса кратко.
6. Засуните отверстие в крышке каждой пробки (предотвратить верхние части хлопающ кипя)
7. Чирей в ванне топления block/water на (95°C) на 5 минут (были показаны, что предотвращают более низкие температуры неспецифичное комплексирование протеина)

После кипеть образцы протеина - нагрузка и ход гель SDS-PAGE

1. Центрифугуйте образцы на 1 минута на high speed.
2. Нагрузите образец в каждую майну.
3. Нагрузите справку mw (трапа молекулярного веса) (вы можете хотеть
4. Побегите гель на 100V (100V до штабелировать гель, напряжение тока можно увеличить до 200V в отделять гель с множеством идущего буфера)

Переход образцов протеина к мембране

1. Подготовьте буфер переноса 1X
2. Выдержите и сотряшите гель в буфере перехода на 15 минут
3. Выдержите мембрану нитроцеллюлозы (или PVDF) и фильтровальную бумагу (экстренно толщиную) на несколько минут.
4. Установьте сандвич на клетке перехода:

Экстренная толщиная ЯСНОСТЬ фильтровальной бумаги
Мембрана
Гель
Экстренная толщиная ЧЕРНОТА фильтровальной бумаги

5. Электрический переход: overnite 35V или 90V на 1 час в зависимости от размера вашего протеина или вашего терпения!

Западный blotting протокол или Immunoblotting

1. Подготовьте 1X TBST от stock разрешений.
2. Подготовьте преграждать буфер (альбумин сыворотки bovine 3% или молоко Блоттинг-stepeni 5% (Blotto) в TBST). (вы можете хотеть попытаться несколько по-разному преграждая времена и условий).
3. Помойте мембрану в 1X TBST с трястить на 10 минут.
4. Блок на температуре комнаты на 1 час с преграждать буфер (трястить или круговой вращатель)
5. Инкубируйте вашу мембрану (PVDF или нитроцеллюлоза) с главным образом антителом 1° ab всю ночь (для трудный blotting подготовляет фосфорилирование ie протеинов) или 1 час для (легкие условия such as полное содержание белков) на 4°C (overnite) или температуре комнаты (инкубации 1 часа только) покрынной с wrap сарана (нежно трястить). Вы можете использовать пластичные ушаты от магазина доллара для этого (используйте эти только для blotting!) или дн коробки пипетки пользы. Разбавление для главным образом антитела вокруг 1:1000. См. инструкции изготовления.
6. Помойте с 1X TBST  3 х 15 минуты
7. Инкубируйте вашу мембрану (PVDF или нитроцеллюлоза) с вторичным антителом, 2° ab на 30 – 45 минут или (1 час - для трудных blotting условий) на температуре комнаты. Разбавление для вторичных антител обычно 1:10,000 или высокими. (ie 1uL вторичного в 10mL TBST в мембрану) см. инструкции изготовления.  Вы можете хотеть добавить ваше антитело к преграждать разрешение для того чтобы уменьшить неспецифичную вязку специально если вы получили высокую предпосылку в вашем первом эксперименте.
8. Мытье с TBST   4-5 х 10 минут. Это будет самый важный моя шаг.
9. Ecl (5min)
10. Публично разоблачение к пленке. Обычно выдержка западных помарок около 10-30 секунд. Более длиной (5-10 минут) для фосфорилирования. Если вы имеете реально слабый сигнал, или, то вы нагрузить больше протеина или попытаться увеличить выдержку (up to 30 минут - вы можете попытаться оставить он в casette более длинним).
11. Держите вашу мембрану! Вы можете держать вашу мембрану в 1X TBST в холодильнике for a while. Вы можете оно для following причин: 1) проверять нагрузку (бумажные рецензенты могут попросить полное содержание белков или стандарт нагрузки such as актин). Также, вы можете зондировать первоначально для фосфоропротеида и после этого strip и reprobe для полного содержания белков.

Также см. наш западный blotting протокол мембраны раздевая