Спонсируйте/Разрекламируйте & Соедините к нам & Свяжитесь мы & О нас & Помогите нам

Молекулярная Биология Blog

Недавние Столбы Форума

 

Иммунопреципитация

Иммунопреципитацией будет метод использует антитела специфически к протеину для того чтобы извлечь те протеины от разрешения. Комплексы антител-proteina осаждены из разрешения с добавлением неразрешимой формы протеинов антитела binding. Примеры вклюают протеин а, протеин г, Zysorbin, Immunoprecipitin, или добавление второго антитела к разрешению (см. диаграмму 1 ниже).

Содержание иммунопреципитации

1. Предпосылка Иммунопреципитации
2. Буфера Иммунопреципитации
3. Недавние Темы Иммунопреципитации
4. Протоколы Иммунопреципитации
5. Информационый бюллетень Иммунопреципитации
6. Статьи Иммунопреципитации
7. Устранять неисправность Иммунопреципитации

Диаграмма 1.

Образцы можно после этого помыть после высыпания и центрифугирования. Преципитаты можно после этого побежать на гелях SDS-PAGE с буфером образца протеина. Обычно образцы протеина radiolabeled до lysis клетки. Это сделано обычно добавлять radiolabeled амино кислоты к клеткам. Это делает вещи просто по мере того как протеин после этого легко обнаружен на пленке после того как он побежав на геле как пятно испустит радиоактивность и подвергнет действию пленка. Вы можете после этого определить для размера протеина (в молекулярном весе с сравнением для того чтобы определить размер стандарты), и количества (путем сравнивать обработанные образцы или к стандарту количеств).

Сверх того, процедура по иммунопреципитации также позволяет концентрацию протеинов которые не очень обильны или трудны для того чтобы обнаружить использующ западную помарку. Ip может сконцентрировать протеины до 10,000-fold по мере того как он может принять большие тома lysates клетки и сконцентрировать ваш протеин интереса в малый преципитат можно после этого использовать для западного анализа помаркой или других методов.

 

Применения иммунопреципитации:

1) определение молекулярного веса и количества immunoprecipitated протеин СДС-ПАГЕ.

2) иммунопреципитация использована для того чтобы определить для взаимодействий протеин-proteina. Это сделано иммунопреципитацией для одного протеина, и после этого blotting для другого протеина.

3) квантификация тарифа синтеза протеина в клетках путем обусловливать протеин количества radiolabeled сделанный во время специфически количества времени.

4) иммунопреципитация включает к концентрации протеинов в противном случае трудно для того чтобы обнаружить.

 

Метод иммунопреципитации можно разделить в несколько шагов:

1. Подготовка образца и lysis клетки
2. Preclearing разрешения
3. Инкубация с антителом и образованием комплексов антител-antigena
4. Высыпание комплекса интереса
5. Запиток комплексов антител-antigena для того чтобы извлечь неспецифичные протеины и загрязняющьи елементы.
6. Анализ complexes/antigen интереса СДС-ПАГЕ

Протоколы Иммунопреципитации	Директория протокола иммунопреципитации (внешние соединения)	Устраньте неисправность: Иммунопреципитация	Выучьте о иммунопреципитации

Подготовка образца иммунопреципитации и клетка Lysis

 

Буфера Lysis Иммунопреципитации

В зависимости от применения иммунопреципитации или ip, вы будете хотеть использовать по-разному буфера lysis.  Выбор буфера lysis важн и зависит на характеристиках протеина интереса.

Если те изучить фосфорилирование протеинов или взаимодействий протеин-proteina, то вы должны попытаться Np-40.

Если вы изучаете уровни полного содержания белков протеина, то вы должны попытаться RIPA.

Буфер RIPA дает более низкую предпосылку в иммунопреципитации. Однако, RIPA может денатурировать некоторые протеины. Если вы дирижируете, то иммунопреципитация экспериментирует для того чтобы изучить взаимодействия протеин-proteina, RIPA не должна быть использована по мере того как она может нарушить взаимодействия protein:protein.

Буфер NP-40 имеет более низкий deanturing уровень, и таким образом использован для экспериментов по фосфорилирования such as смотреть деятельность при киназы. Также NP-40 использовано для взаимодействий протеин-proteina. NP40 будет non-ionic тензидом, и будет само общ используемым тензидом в буферах lysis клетки для иммунопреципитации и западной помарки.

Буфер Lysis Клетки RIPA - Recipe Буфера Иммунопреципитации

• 50 миллиметров Tris-HCl
• Отрегулируйте к pH 7.4
• 150 миллиметров naCl
• 1 миллиметр PMSF
• ЭТИЛЕНДИАМИНТЕТРАЦЕТАТ 1 миллиметра
• 5 µg/ml Aprotinin
• 5 µg/ml Leupeptin
• 1% тритон x-100
• дезоксихолат натрия 1%
• 0.1% Sds

Буфер Lysis Клетки NP-40 - Recipe Буфера Иммунопреципитации

• 50 Tris-HCl миллиметров концентрации выпускных экзаменов
• 150 naCl миллиметров концентрации выпускных экзаменов
• Добавьте 1% NP-40
• Отрегулируйте к pH 8.0

Пре-rascistka для иммунопреципитации

Preclear шаг обычно сделан для иммунопреципитации потому что он понижает количество неспецифичных протеинов в lysate клетки. Furthermore, пре-rascistka также извлекает протеины которые могут иметь по возможности неспецифичные взаимодействия и высокое сродство для протеина а, протеина г, Immunoprecipitin, Zysorbin, или любые неразрешимой форме протеина антитела binding вы используете к опрокинутому ваше антитело. Некоторые исследователя считают этот шаг ненужной и прыгают этот шаг. Пре-rascistka попытки the first time вы попытаетесь иммунопреципитация. Если ваши результаты довольно ясны, то попытайтесь прыгнуть эксперимент по пре-rascistki следующий и см. как он поворачивает вне.

 

Ip: Антитело инкубации и образование комплексов Антител-Antigena

Которое антитело должны вы использовать для иммунопреципитации? Обычно антитела Polyclonal использованы для immunoprecipation.

 

Иммунопреципитация - высыпание комплекса интереса

Комплексами антител-antigena не неразрешимы собой, иммунопреципитацией ie., не будут вполне идея. Антитела и их вязка к антигенам soluble в крови, буферах, и во время эксперимента по иммунопреципитации.  Использовано для того чтобы осадить из этих комплексов будет протеинами неразрешимого антитела binding. Протеины а и г, были изолированы от бактерий, и связывают к постоянн зоне антитела.

Примеры протеинов неразрешимого антитела binding используемых для того чтобы осадить комплексы в иммунопреципитации являются следующими:

• Протеин А
• Протеин Г
• Zysorbin
• Immunoprecipitin

Иммунопреципитация - Моя Шаги

  Мыть комплексы сделан использующ RIPA, PBS, ИП-moet буфер, или другие буфера в зависимости от вы хотел были бы проанализировать после ip. Буфер RIPA stringentee тогда как PBS более менее stringent.

Recipe Буфера Мытья Ip

• 10mM Tris; Отрегулируйте к pH 7.4
• ЭТИЛЕНДИАМИНТЕТРАЦЕТАТ 1mM
• 1mM EGTA; pH 8.0
• naCl 150mM
• 1% тритон X-100
• натрий 0.2mM ortoy1-vanadate
• коктеил иа АБС битор протеазы

 

Окончательные примечания для иммунопреципитации

  Успех иммунопреципитации зависит на сродстве антитела для своего антигена.  Хорошее антитело иммунопреципитации передаст вам низкая предпосылка когда вы проанализируете образцы использующ другие методы после ip.  Неразрешимые антител-sv4zyva4 используемые протеины также очень важны. Антитела Polyclonal будут самыми лучшими антителами для использования однако очищенных моноклональных антител можно также использовать.  Проверите вашего поставщика антитела для того чтобы увидеть если ваше моноклональное антитело было испытано для иммунопреципитации.

 

Концы для иммунопреципитации

• Используйте пробки 2 mL для иммунопреципитации по мере того как они осаждают легко помыты и ресуспензированы
• Попытайтесь прыгнуть шаг пре-rascistki для того чтобы сохранить время
• Вместо мыть с ИП-pomo1te попытку PBS буфера
• Если вы уже имеете низкую предпосылку и ваше антитело больш, то попытайтесь ip моя 2X вместо 5X
• Make sure вы извлечь как много жидкость от пробок eppendorf когда запиток иммунопреципитации

Станция Авторского права 2006-2008 Молекулярная