Bioinformatics, Протоколы, Протеин Proteomics RNA ДНАА

домашн > pcr > истори--пчр > index.php

Протоколы PCR	PCR Bioinformatics и базы данных	Выучьте о PCR	Наборы и продукты PCR	Форум PCR	Книги PCR

История и развитие цепной реакции полимеразы (PCR)

Также станция посещения PCR

Авторское право MolecularStation 2006

Цепная реакция Полимеразы - PCR

Содержание:

Введение к PCR - цепная реакция полимеразы 

Цепная реакция Полимеразы (PCR)

PCR, принципиальная схема, котор нужно открыть

Общийа принцип PCR

Характерность и эффективность Polymerases/Reaction

Общее назначение PCR

PCR и молекулярное клонирование

Misincorporation: Ошибки in vitro систем

Характерность Реакции

Главные преимущества PCR как метод клонирования вклюают свои внезапность, чувствительность, и робастность

Ограничения PCR

Аппаратуры для PCR

Синтез Олигонуклеотида

Более Primer Конструкция

PCR Сегодня

PCR всегда будет заменено? – Юеличасе-zavisima4 Амплификация (HDA)

Введение к PCR - цепная реакция полимеразы 

            Больше чем 30 лет тому назад, введение рекомбинатной технологии ДНАА по мере того как инструмент для биологических наук революционизировал изучение жизни.  Молекулярное клонирование позволило изучение индивидуальных генов living организмов; однако этот метод зависел на получать относительно большое количество чисто ДНАА.  Это зависело на репликации ДНАА плазмид или других векторов во время разделения клетки микроорганизмов (1).  Исследователя считали его весьма laborious и трудным для того чтобы получить специфически ДНАО в количестве от массы генов присытствыющих в биологическом образце (2).   Рекомбинатная технология ДНАА делала возможным первый молекулярный анализ и пренатальный диагноз нескольких людских заболеваний.  Фетальное ДНАО полученное забором amniocentesis было в состоянии быть проанализировано пищеварением энзима ограничения, электрофорезом, южным переходом и гибридизацией к клонированному гену или зондам олигонуклеотида (3).  Однако, южный blotting позволил только зачаточный составлять карту генов в unrelated индивидуалах (4). 

Цепная реакция Полимеразы (PCR)

PCR, акроним для цепной реакции полимеразы (5.6), позволило продукцию больших количеств специфически ДНАА от сложного шаблона ДНАА в просто ферментационной реакции.  PCR будет недавн начатой процедурой для in vitro амплификации ДНАА.  PCR преобразовывало дорогу почти все изучает требовать манипуляции частей ДНАА может быть выполнено как результаты своих простоты и пользы (7). 
В й980с, Kary Mullis (рисунок 1) и команда исследователей на Четус Корпорации на Четус Корпорации поняли дороги начать и остановить действие полимеразы на специфически этапы вдоль одиночной стренги ДНАА.  Mullis также осуществило что путем обуздывать этот компонент молекулярной технологии воспроизводства, ДНАО цели смогло степенно быть усилено.  Эта процедура по амплификации ДНАА была основана на in vitro rather than в процессе vivo (5.6.8).  Cell-free амплификация ДНАА ПЧР могла упростить много из стандартная процедура для клонирования, анализируя, и дорабатывая нуклеиновых кислот (1).  Ранее методы для изолировать специфически часть ДНАА положились на гене клонируя – нудную и медленную процедуру.  PCR, с другой стороны Kerry заявленное Mullis “препятствует вам выбрать часть ДНАА вы’re заинтересованное внутри и иметь как много из его по мере того как вы хотите” (2.8).   Когда другие научные работники Cetus окончательн преуспетые в делать полимеразой цепную реакцию выполнят как пожелано в надежном способе, они имели больш мощный метод для обеспечивать необходимо unlimited количества точных генетических материальных молекулярных biologists и других требуемых на их работа (8).  С первого рапорта in1985, больше чем 5000 научныйа труд были опубликованы 1992 (1).  Furthermore, the large number of изданий of course делают его невозможным рассмотреть все важныйа вклад к развитию и применению технологии PCR; однако мы попытаем рассмотреть здесь самые важные развития в практике основного PCR. 

PCR, принципиальная схема, котор нужно открыть

Было подуманы, что было понято PCR Др. Керры Муллис в 1983 пока работающ на Четус Корпорации в Emeryville, ca.  Однако, некоторый novatorski1a работ также был сделан Гобинд Кюорана в 1971 описало основныа принципы копировать часть ДНАА использующ 2 праймера.  Прогресс после этого был ограничен более primer вопросами очищения синтеза и полимеразы (9).   В головке’Mullis с, выросли, что от теоретической схемы выполнил вымысел лимитированный sequencing dideoxynucleotide уникально людских генов использующ синтетические олигонуклеотиды for the purpose of диагностируя общие людские перегласовки заболеванием.  Очевидной препоной к такой сразу sequencing стратегии была высокая сложность людских пар генома (3.3 х 109 низкопробных).  Таким образом, были добавлены, что преградили вторые олигонуклеотид или праймер прогрессирование синтеза первого праймера.   Более поздно однако, этот второй праймер был включен для того чтобы связать к другой стренге ДНАА, так НОП каждая стренга аллеля мутанта способствовала бы к окончательному сигналу.  Если схема включая одновременную гибридизацию праймеров к каждой стренге была доработана путем нагревать смесь и после этого повторять отжиг и шаги выдвижения, то главным образом сигнал был бы увеличенные даже дальнейшими.  Повторять шаги позволил бы продукты первого круга быть дублированным в втором цикле, для того чтобы произвести 2 экземпляра.  Повторять цикл снова приводил бы к в 4 экземплярах, et cetera.  Несколько неделей прошли прежде чем эта большая идея была попытана (8).  2 праймера были синтезированы для того чтобы быть совершенно комплементарны к каждому концу низкопробной зоны пары 110 клонированного этапа людского гена b-globin, амплификация была выполнена, и продукты были определены электрофорезом геля акриламида.  Конечным результатом было предвидимой низкопробной частью ДНАА пары 110 и началом PCR как основной метод в молекулярной биологии (5.6).
В PCR Mullis's первоначально process(5,6,8), энзим был использован in vitro (в регулируемой среде вне организма).  Double-stranded ДНАО было отделено в 2 одиночных стренги путем нагревать его к 96°C.  На этой температуре, однако, была разрушена полимераза ДНАА E.Coli так НОП энзим должен быть пополнен после этапа топления каждого цикла.  Процесс PCR Mullis's первоначально был очень неработоспособен в виду того что он требовал много времени, более обширного количества Дна-Polimerazy, и постоянно внимания в течении процесса PCR.

Общийа принцип PCR

            Рассмотрение механизма амплификации PCR показывает свою простоту но также свою элегантность (рисунок 2).  Праймеры олигонуклеотида сперва конструированы для того чтобы быть комплементарны к концам последовательности, котор нужно усилиться, и после этого смешанную в молярном избытке с шаблоном ДНАА и deoxyribonucleotides в соотвествующем буфере.  Следуя за топление для того чтобы денатурировать стренги оригинала и охлаждать для того чтобы повысить более primer отжиг, олигонуклеотиды каждый bind к по-разному стренге части цели.  Праймеры расположены так НОП когда каждое будет расширено действием полимеразы ДНАА, нов синтезированные стренги перекроют связующий сайт противоположного олигонуклеотида.  По мере того как продолжен процесс denaturation, отжига, и выдвижения полимеразы праймеры повторно связывают как к первоначально шаблону ДНАА так и к комплементарным местам в нов синтезированных стренгах и удлинены для того чтобы произвести новые экземпляры ДНАА (рисунка 3).  Конечным результатом будет степенное увеличение в полном количестве частей ДНАА вклюают последовательности между праймерами PCR, которые окончательно представлены на теоретическом обилии 2n, где н будет число циклов (1.7.13).

Характерность и эффективность Polymerases/Reaction

Полимераза ДНАА будет естественно происходя энзимом, биологической макромолекулой которая катализирует образование и ремонт ДНАА. Она работает путем связывать к одиночной стренге ДНАА и создавать комплементарную стренгу.  Точная репликация полностью living дела зависит на этой работе, где она действует для того чтобы дублировать ДНАО когда клетки разделяют (10.11).  Только недавн имейте научных работников выучено манипулировать эту работу и приложить ее к научному исследованию.  Самые предыдущие эксперименты по PCR utlilized часть Klenow полимеразы iego ДНАА coli эшерихий на температуре 37C для того чтобы усилить специфически цели от людского genomic ДНАА (5.6).  Часто эти реакции PCR производили неполно чисто продукт цели как рассужено электрофорезом геля (1).  Эти первоначально амплификации PCR с частью Klenow не были высоки специфически (5.6).  Хотя уникально частью ДНАА смогла быть усиленная створка ~200,000 от genomic ДНАА, только около 1% из продукта PCR было пристрелнной последовательностью (13).  Необходим, что проанализировал специфически зонд гибридизации усиленное ДНАО (5.6).  
Были обусловлены, что увеличили условия некоторого PCR stringency более primer гибридизации such as более низкая концентрация mgCl2 и более высокие температуры отжига.
Furthermore, были найдены, что произвели эффект концентрация энзима и праймеров, время отжига, время выдвижения, и количество PCR задействуют все характерность PCR.
Также, концентрация специфически последовательности в образце может также влиять на относительную гомогенность продуктов PCR (1.7.13.14.15).   Triphosphates и магний Deoxyribonucleotide в соотвествующем буфере будут также важными ингридиентами для PCR.  Эффективность и характерность PCRs могут быть повлияны на изменениями в концентрации и коэффициенте свободно магния, triphosphates deoxyribonucleotide, и праймеров.  Эти реагенты необходимо оптимизировать для того чтобы достигнуть высокой характерности и произвести (14).  Также было открыно что влияние температуры и длины праймера олигонуклеотида на характерности и эффективность амплификации цепной реакцией полимеразы (15).
Инактивирование части Klenow полимеразы iego ДНАА coli эшерихий на высокой температуре необходимо для разъединения стренги требовало добавления энзима после шага denaturation каждого цикла (5.6).  До 1988, любое дирижируя процедуру по реакции PCR было обязано для того чтобы сидеть терпеливейше серией ванн воды или нагрюя блоков и добавить свежий аликвот полимеразы ДНАА E.Coli после каждого шага denaturation, который типично был снесен вне путем погружать реактивный сосуд в кипя воде для ½ минута до 3 минуты (7).   Этот довольно нудный шаг был исключен введением термостабильной полимеразы ДНАА, полимеразы ДНАА Taq (12) раз, на начале реакции PCR.  Термостабильные свойства деятельности при полимеразы ДНАА были изолированы от aquaticus Thermus (Taq) (рисунок 4) растут в гейзерах излишек 110C, и способствовал больш к выходу, характерности, автоматизации, и общему назначению цепной реакции полимеразы (1.7.12).   Энзим Taq может выдержать повторное топление к 94C и так each time смесь охлажена для того чтобы позволить праймеры олигонуклеотида связать катализатор для выдвижения присутствует уже (1.7).  Однако, более высокие температуры отжига не установить до одиночного “самого важного развития развития PCR” (8), очищения и коммерчески распределения теплостойкой полимеразы ДНАА от термофильного aquaticus Thermus бактерии (Taq) (12). 
Изоляция теплостойких отжига и выдвижения полимеразы ДНАА также позволенных более primer, котор нужно снести вне на повышенные температуры (1.7.12.13), таким образом уменьшая рассогласовала отжиг к последовательностям nontarget (неспецифичной амплификации) или увеличивая характерности.   В этой дороге, потому что много амплификаций продукт PCR смог быть обнаружен как одиночным полоса бромид-zap4tnanna4 ethidium на электрофорезном геле (12).  Эта увеличенная характерность также увеличила выход ДНАА последовательности цели.  Сверх того, более длинние продукты PCR были в состоянии быть усилены от genomic ДНАА, вероятно должного к уменьшению в вторичной структуре стренг шаблона на повышенной температуре используемой для более primer выдвижения.  Верхний предел размера для амплификации полимеразы части Klenow был только о 400bp.  Полимераза Taq и другие термостабильные полимеразы синтезировали части up to 10 kb (1.7.12.13).  Наличие полимеразы Taq также больш упрощало автоматизацию реакции по мере того как будет гораздо легке задачей построить прибор задействует пробку реакции через по-разному температуры чем изготовить приспособление выполнило бы и thermocycling и добавление аликвотов энзима.  В настоящее время будет большое разнообразие имеющихся thermocyclers коммерчески.  Этим развитием был значительно фактор в быстро применении этой технологии научной общиной (7). 

Общее назначение PCR

            В дополнение к продукции double-stranded, туп-zakoncennyx частей ДНАА которые могут быть сформированы ПЧР, 2 других характеристики PCR замышляют способствуют больш к общему назначению PCR.  Во первых, положение вязки праймеров определяет границы усиленной части и поэтому прежнее молекулярное требование к клонирования мест опознавания эндонуклеазы ограничения необходимо для PCR.  По мере того как только лимитированным количеством последовательностей ДНАА будет места ограничения, PCR больш увеличивает гибкость выбора размера и состава части.  Secondly, не обязательно для олигонуклеотидов PCR быть точно комплементарно к ДНАУ шаблона.  “Кабели” могут быть добавлены, что к концу’ 5 праймера ввели последовательности внутри места затравки таким образом могут быть эксплуатированы для того чтобы ввести места опознавания эндонуклеазы ограничения или другие полезные последовательности such as перегласовки в усиленное ДНАО.  Эт явления позволили эмерджентность PCR как метод для быстро клонирования ДНАА (1.7.13).

PCR и молекулярное клонирование

Молекулярное клонирование помогало от эмерджентности PCR как метод.  Сразу клонирование сперва было дирижировано использующ часть ДНАА 110 bp усиленную ПЧР и праймеры олигонуклеотида содержали места опознавания эндонуклеазы ограничения добавили к их 5’ концам.  Эти места были использованы для того чтобы облегчить клонирование усиленного ДНАА в плазмиду M13 (17).  Часть 110 bp также была sequenced для того чтобы подтвердить что этим подходом был быстро но надежный подход к клонированию.  (рисунок 5)

Misincorporation: Ошибки in vitro систем

Cell-based клонирование ДНАА включает репликацию ДНАА в vivo, который связан с очень точный копировать из-за proofreading механизмы.  Однако, когда ДНАО скопировано in vitro как с PCR, копируя тариф ошибки значительно большле.  Само широко используемая полимераза, полимераза ДНАА Taq однако, не имеет никакое associated exonuclease’3 до’ 5, котор нужно посовещаться proofreading функция.  Таким образом тариф ошибки должный к низкопробному misincorporation во время репликации ДНАА довольно высок для Taq: для 1 kb sequence проходил 20 эффективных циклов дублирования, приблизительно 40% из новых стренг ДНАА синтезированного ПЧР используя этот энзим содержит неправильно нуклеотид приводящ к от копируя ошибки (16).  Поэтому, even if реакция PCR включает амплификацию одиночной последовательности ДНАА, окончательный продукт будет смесью почти сопрягать, но идентичными последовательностями ДНАА.  Несмотря на ошибки должные к репликации in vitro, sequencing ДНАА полного продукта PCR может дать правильно последовательность должную к факту что внесение неправильно оснований необходимо случайно и вклад одного неправильно основания на one or more стренгах overwhelmed вкладами от огромного большинства стренг которые будут иметь правильно последовательность.  Однако, если продукт PCR должен быть клонированным в клетках, то нескольк индивидуал клонирует может быть sequenced для того чтобы обусловить правильно последовательность (консенсуса), до дирижируя более добавочных экспериментов.
Недавн, проблема infidelity репликации ДНАА во время реакции PCR значительно была уменьшена путем использование других heat-stable полимераз ДНАА которые связывали деятельность при’ exonuclease 3’ до 5.  Полимеразы ДНАА furiosusPyrococcus(Pfu) и Thermococcus Litoralis (СБРОС) становят широко использовали из-за proofreading посовещанный деятельностью при их associated’ exonuclease 3’ до 5 (18).  Приводя к продукт PCR Pfu например, имеет много lower level перегласовок введенных путем копировать ошибки: для этапа 1 kb ДНАА проходило 20 эффективных циклов дублирования, около 3.5% из ДНАА садят на мель в продукте носят измененное основание (16).

Характерность Реакции

Были начаты новыйа подход для того чтобы улучшить характерность основали на опознавании что полимераза ДНАА Taq сохраняет значительную ферментационную деятельность на температурах наилучшим образом под оптимальным для синтеза ДНАА.  Таким образом, праймеры обжигая non-specifically к частично одиночной, котор сели на мель зоне шаблона могут быть продленны прежде чем реакция достигает 72°C для выдвижения специфически обжженных праймеров.  Если полимераза ДНАА активирована, то only after реакция достигала высокие (> 70°C) температуры, амплификацию нон-qeli можно уменьшить (19.20).  Этот “подход к горячего” старта может быть выполнен ручным добавлением необходимого реагента к пробке выбора на повышенных температурах.  Было сообщены, что увеличивает добавление протеина ssDNA binding также специфически амплификацию.  Больше подхода к потребителя содружественного должен использовать или ингибитирование самого или инактивирование полимеразы ДНАА.  2 типа ингибитирования полимеразы ДНАА Taq были попытаны включая ингибитирование олигонуклеотида (21) и ингибитирование антитела (22). Высоки были произведены специфически иы АБС битор олигонуклеотида обеих полимераз ДНАА Taq.  Эти селективно блокируют деятельность при полимеразы ДНАА на температурах под 40°C и были показаны к функции в применениях горячего старта.  Друг, одно может использовать антитело против полимеразы ДНАА Taq. Антитело блокирует полимеразу ДНАА до тех пор пока температура PCR не быть такое что антитело денатурировано на температуре greater than 55°C, таким образом выпуская энзим.  Как бы будут недостатки к этому типу условий горячего старта.  In this case, одно антитело для каждого по-разному энзима используемого в PCR и для большое количество PCRs это может поднять цены значительно.  Самая удобная форма горячего старта должна доработать полимеразу ДНАА in such a way that она бездействующа на температуре комнаты (температур-cuvstvitel6nom мутанте), и только реактивирована после инкубации на 95°C на 6-15 минут (23).  

Главные преимущества PCR как метод клонирования вклюают свои внезапность, чувствительность, и робастность

Из-за своей простоты, PCR будет популярным методом с широким диапозоном применения
включая сразу sequencing, genomic клонирование, ДНАО печатая на машинке, обнаружение заразных микроорганизмов, мест-napravlenny1 мутагенез, пренатальное генетическое исследование заболеванием, и анализ allelic изменений последовательности (1.7.13.16) которых зависят на необходимо 3 главных преимуществах метода:

Скорость и легкость пользы:   Клонирование ДНАА ПЧР можно выполнить в относительно скоро количестве времени, в пределах немного часов.  Обычно, реакция PCR состоит вокруг 30 циклов каждый цикл содержа denaturation, синтез и reannealing шаг, при индивидуальный цикл типично 35 минут в автоматизированном термально cycler.  Это ясно быстроее чем время необходимо для cell-based клонирования ДНАА, которое смогло принять недели времени.  Furthermore, довольно легко setup реакция PCR и польза машины thermocycler также легка.  Некоторое время необходимо для конструкции и синтеза праймеров олигонуклеотида, но это было упрощано наличием средства программирования компьютера для более primer конструкции и быстро коммерчески или академичным синтезом custom олигонуклеотидов.   Оптимизирование условий PCR может необходимо such as более primer температура отжига, концентрация магния, и более primer концентрация.  Однако, творение машин градиента PCR которые позволяют разнообразие более primer температур отжига быть испытанным в то же самое время больш уменьшило время необходимо для этого шага.  Раз оптимальные условия для реакции были получены, реакция можно после этого просто повторить (1.7.13.16). 

Чувствительность:  PCR способно усиливать последовательности от мельчайшего количества ДНАА цели, даже ДНАО от single cell (24).  Такая восхитительная чувствительность позволяла новые методы изучать молекулярный патогенез и находила многочисленн применения в судебнохимической науке, в диагнозе, в генетическом анализе рычага использующ одиночн-spermu печатая на машинке и в молекулярных изучениях paleontology, где образцы могут содержать мельчайшие числи клеток. Однако, весьма чувствительность метода намеревается что большаяа забота должен быть принят для избежания загрязнения исследуемыйа образец внешним ДНАОМ, such as от мельчайшее количество клеток от оператора (1.7.13.16).

Робастность:  Обширным рядом источников нуклеиновой кислоты будет целесообразные шаблоны для амплификации PCR.  Были усилены очищенное DNAs от различного вида и источники.  PCR может позволить амплификацию специфически последовательностей от материала в ДНАО плох ухудшено или врезано в средстве от обычная изоляция ДНАА проблемна. В результате, снова очень целесообразно для молекулярной антропологии и paleontology изучает, например анализ ДНАА взятый от археологического остатка. Он также был использован успешно для того чтобы усилить ДНАО от формалин-fikcirovannogo или парафин-vrezannye образцы ткани, которая имеет важные применения в молекулярной патологии и, in some cases, генетическом рычаге изучают.  Вообще, успех амплификации PCR самая большая когда части цели относительно обильны (1.7.13.16). 

Ограничения PCR

Несмотря на свое огромное славолюбие, PCR имеет некоторые ограничения как метод для селективно клонировать специфически последовательности ДНАА. 
Для того чтобы построить специфически праймеры олигонуклеотида позволяют селективную амплификацию определенной последовательности ДНАА, некоторые прежние данные по последовательности обычно обязательно.  Это нормальн намеревается что зона ДНАА интереса отчасти была охарактеризована ранее, часто following прежнее cell-based клонирование ДНАА.  Однако, разнообразие подходов было начато которые уменьшают or even исключают потребность для прежних данных последовательности ДНАА по ДНАО цели.  Ранее uncharacterized последовательностями ДНАА можно иногда клонировать использующ PCR с дегенеративными олигонуклеотидами если они будет членами гена или repetitive семьей по крайней мере одним, то ДНАА членов ранее характеризует.   In some cases, PCR можно использовать эффективно без любых прежних данных последовательности по ДНАО цели для того чтобы позволить indiscriminateamplification последовательностей ДНАА от источника ДНАА которое присутствует в extemely лимитированных количествах.  Поэтому, хотя PCR можно приложить для того чтобы обеспечить всю амплификацию генома, оно не имеет преимущество cell-based клонирования ДНАА в предлагать дорогу отделять индивидуальное ДНАО клонирует состоять из genomic архива ДНАА.
Количество продукта PCR полученное в одиночной реакции также очень ограничиватьле чем количество можно получить использующ cell-based клонирование где vycislite по маштабу-вверх томов культур клетки по возможности. Эффективность реакции PCR поменяет от шаблона к шаблону и согласно различным факторам необходимо, что оптимизируют реакцию но типично только сравнительно достигано малое количество продукта.
Хотя теоретический выход PCR степен, фактический выход PCR очень более менее показывает что схема работает с чем свой максимальный потенциал.  Например, количество продукта на каждом цикле окончательн выравнивает.  Это плато может быть объяснено following явлениями.  Во первых, некоторый из шаблона может никогда не быть имеющиеся должными к проломам стренги или отказу ДНАА к после того как оно разъединено от других макромолекул во время очищения и первоначально thermocycles.  Secondly, количество энзима небесконечно и окончательн деятельность может уменьшить.  Thirdly, по мере того как концентрация double-stranded продукта достигает высокие уровни, конкуренция увеличивает между отжигом шаблона (продукта PCR) к праймеру и reannealing комплементарных стренг шаблона (1.7.13).
Много времен большой недостаток очевидного и PCR как метод клонирования ДНАА был рядом размера последовательностей ДНАА можно клонировать.  Не похоже на cell-based клонированию ДНАА где размер клонированных последовательностей ДНАА может причалить mb 2, сообщенному последовательности ДНАА клонированные ПЧР типично находитесь в 0.15 kb ряда размера, часто на нижнем конце этого маштаба.  Малые части ДНАА могут обычно быть усилены легко ПЧР, тем ме менее будет все больше и больше трудне получить эффективную амплификацию по мере того как заданная длина продукта увеличивает.  Barnes (25) узнало ограничение длины цели к амплификации PCR ДНАА.  Он использовал комбинацию высокого уровня ехонучлеасе-svobodno, мутанта пропускания Н-sterjn4 полимеразы ДНАА Taq, Klentaq1, с очень низким уровнем термостабильной полимеразы ДНАА exhibiting деятельность 3'-exonuclease (Pfu, сброс, или глубокий сброс) для того чтобы дирижировать точный длиннее PCR. По крайней мере 35 kb бактериофага lambda можно усилиться к высоким выходам от 1 ng шаблона ДНАА lambda.  Польза этого метода произвела увеличенную точность воспроизведения основани-pary, способность использовать продукты PCR как праймеры, и максимальный выход части цели.  Другия условия были определены для эффективной амплификации более длинних целей, включая амплификацию up to 22 kb beta-globin группы гена от людского genomic ДНАА и up to 42 kb от ДНАА lambda phaga (26).  Условия для этими длиннего pH включенного PCRs увеличенного, добавления глицерола и этанного сульфоксида, уменьшили времена denaturation, увеличенные времена выдвижения, и пользы вторичной термостабильной полимеразы ДНАА которая обладает 3'-to 5'-exonuclease, или "proofreading," деятельность.  "протокол длиннего PCR" поддерживал характерность необходим для целей в genomic ДНАЕ путем использование более низких уровней полимеразы и условий температуры и соли для специфически отжига праймера.  Способность усилить последовательности ДНАА 10-40 kb принесет скорость и простоту PCR к genomic составлять карту и sequencing и облегчит изучения в молекулярных генетик (26).  Вообще, условия для длиннего ряда PCR включают комбинацию изменений к стандартным условиям с системой 2-polimerazy.  Это обеспечивает оптимальные уровни деятельности при полимеразы и exonuclease’3 до’ 5 ДНАА служит как proofreading механизм (16).

Аппаратуры для PCR

Thermocyclers автоматически регулируют температуры для задействовать PCR было введено в 1986 (рисунок 6).  В дополнение к выдвижениям в реагенты PCR, были развиты новые аппаратуры для автоматизированного восходящего потока теплого воздуха задействуя и для анализировать продукты PCR.  Новые термально cyclers увеличивали тарифы топления, охлаждающ, и передачи тепла к доработанным реактивным сосудам.  Реактивные сосуды приспособленные cyclers первого поколения термально (or even ваннами воды и блоками топления) были стандартными пластичными пробками microfuge.  Амплификация PCR в тонких capillary пробках позволила быстро термально задействовать, и синтез ДНАА к 20s.  Скорость достиганных изменений температуры в этих системах позволила точное определение оптимальных температуры для каждого индивидуального шага в цикл PCR.   Cyclers нового поколение термально также приспосабливают больше образцов, имеют более точные термально профили, и programmable (13). 

Синтез Олигонуклеотида

Один из наименьших appreciated вкладов к widespread применению PCR было развитием надежной автоматизированной химии для синтеза олигонуклеотида.  Until recently, конструкцией одиночного олигонуклеотида была существенная задача которая смогла только быть выполнена skilled органическим chemist.  Теперь по возможности закупить любо синтезатор олигонуклеотида может управляться техником сами или олигонуклеотидами от коммерчески или академичного источника.  Мултиплексные машины синтеза олигонуклеотида были построены с целью уменьшения общей цены синтеза (27.28).  По мере того как олигонуклеотиды определяют окончательные продукты PCR, there is little doubt that в отсутствии их готовой поставкы, PCR не насладилось широким принятием которое оно приобретало сегодня (13). 

Более Primer Конструкция

Исследователя согласились early on что конструкция праймеров PCR была трудна и ненадежна.  Компьутерные программы были изобретены для того чтобы принять все из требований к конструкции into account.   Одна из первых программ написанных для более primer конструкции было Olga сделало пользу вставкы САМОЦВЕТА исследования цифров (менеджера окружающей среды графиков) на st Atari (29).  Olga специфически было одето к цепной реакции полимеразы (PCR) позволяя одновременный анализ 2 более primer последовательностей.  Преимущество Olga было что оно обеспечило в анализах одной программы для сразу повторений, вторичных структур и более primer димеризации так же, как несколько полезных инструментов ' отделкой ' для работников включенных в синтезах оптимизирования и олигонуклеотида PCR.   Подуманы, что будет программа Primer3 на институте Whitehead теперь самый надежный и самый разносторонний инструмент currently available (30).

PCR Сегодня

PCRs можно теперь выполнить включающ амплификацию частей ДНАА до нескольких kilobases в длине к больше чем миллионо времен их первоначально обилие.  Процедура высоки automatable и требует как раз немного часов от начинать thermocyling к анализу продукта.  Это не было случаем ранее, и практически требования для выполнять PCR больш были упрощаны с первых рукописей метода (13).  Сегодня, большая часть из первоначально заминк или inefficiencies PCR работались из (8).   Furthermore, PCR расширяло для того чтобы включить больше чем 270.000 статьей (31).

PCR всегда будет заменено? – Юеличасе-zavisima4 Амплификация (HDA)

  Цепной реакцией полимеразы будет само широко используемый метод для in vitro амплификации ДНАА однако, котор она требует термально denaturation или thermocycling для того чтобы отделить 2 стренги ДНАА.  В vivo, ДНАО скопировано полимеразами ДНАА с различными вспомогательными протеинами.   Действуют, что отделяет helicase ДНАА, протеины полимеразы ДНАА вспомогательные двухшпиндельное ДНАО внутри клеток.  Винчент et al. (32) изобретало новый in vitro изотермический метод амплификации ДНАА путем передразнивать в механизме репликации vivo.  Юеличасе-zavisima4 амплификация (HDA) использует helicase ДНАА для того чтобы произвести, котор одиночн-seli на мель шаблоны для более primer гибридизации.  Затем выдвижение праймера после этого катализировано полимеразой ДНАА.  HDA не требует дорогего thermocycler и таким образом PCR может быть выполнено практически где-либо.  In addition, оно предлагает несколько преимуществ над другими изотермическими методами амплификации ДНАА путем иметь просто схему реакции и быть поистине изотермической реакцией которую можно выполнить на одной температуре для всего процесса. HDA предлагает большой посыл в развитии приспособлений просто портативного ДНАА диагностических быть использованным в поле и на пункт-$$$-VNIMATEL6NOSTI (32).

Заключения

Сказано просто и самая удобная дорога определить PCR как метод.  Однако, такая категоризация исключает историю развития PCR's так много индивидуалы над летами способствованными к идеям за теорией PCR и точн-nastraivat6 метода.  Следующий просто ответ должен назвать индивидуала как изобретатель цепной реакции полимеразы.  Наградило Karry Mullis Nobelevska4a премия для химии в 1993 для его открытия PCR.  Однако, это открытие оспорено amongst много научных работников, все из которых могут способствовать к открывать эту головоломку.
Также было сказано что PCR не существовало до тех пор пока оно не сделать для работы в экспириментально системе.  С этим в разуме, просто мысль принципиальной схемы не достаточно; принципиальную схему необходимо успешно положить в практику (33).      
Хотя будет сомнение о предельном создателе PCR, и сомнение о возможности что PCR смогите как-то или когда-то быть заменено, немногая сомнение удар который PCR создавало над пядью короткийа срок на изучении молекулярных биологии и жизни.

Справки

1.         Arnheim, Н; Erlich, Ю;  Стратегия Цепной реакции Полимеразы. ЕЖЕГОДНОЕ ОБОЗРЕНИЕ БИОХИМИИ, VOL 61. XIV+1359P. , 1992. P 131-156.
2.         Appenzeller T Демочратизинг последовательность ДНАА, Наука, 1990 март 2, 247(4946).
3.         Saiki Р, K; Scharf С; Faloona Ф; Mullis K Б; Рожочок G Т; Erlich Ю. A; N Arnheim, ферментационная амплификация beta-globin genomic последовательностей и анализ места ограничения для диагноза малокровия клетки серпа, Науки, dec 1985 20, 230(4732):1350-4.
4.         Южно, E.M. (1975) Обнаружение специфически последовательностей среди частей ДНАА отделилось электрофорезом геля. J Mol. Biol. 98:503-518.
5.         Mullis K Б; Faloona Ф. А; Scharf С; Saiki R К; Рожочок Г; Erlich Ю. A, специфически ферментационная амплификация ДНАА in vitro: цепная реакция полимеразы. Холодныесимпозиумыгавани весны на количественной Биологии, 1986
6.         Mullis K Б; Faloona Ф. A Специфически синтез ДНАА in vitro через полимераз-katalizirovannuh цепную реакцию. Методы в Энзимологии, 1987, 155:335-50.                
7.         Gibbs, R.A; Амплификация ДНАА цепной реакцией полимеразы.  Аналитическая химия, 1990, 62:1202-1214.
8.         Mullis, K.B; Необыкновенное начало цепной реакции полимеразы, научного американца, 1990 -го апреля.
9.         Kleppe, KE; Khorana,Гектограмм; (1971) J Mol. Biol. 56, 341-346.
10.       Keir, Ю; Полимеразы ДНАА от mammalian клеток. Mol Biol Res Нуклеиновой Кислоты Prog. 1965;4:81-128.
11.       Fansler, BS; Полимеразы ДНАА Eukaryotic: их ассоциация с ядром и отношение к репликации ДНАА. Внутренне Rev Cytol. 1974;Suppl 4:363-415.
12.       Saiki R К; Gelfand D Ю; Stoffel С; Scharf S Ж; Higuchi Р; Рожочок G Т; Mullis K Б; Erlich Ha. Праймер-napravlenna4 ферментационная амплификация ДНАА с термостабильной полимеразой ДНАА. Наука, 1988 Январь 29, 239(4839):487-91.
13.       Erlich, Ю. А; Gelfand, Д; Sninsky, J J Недавн Выдвигать в цепной реакции полимеразы, Наука, 1991, v.252, n.5013, 1643-1651.
14.       Williams, JF; Стратегии оптимизирования для цепной реакции полимеразы. Biotechniques. 1989 Jul-Aug;7(7):762-9.
15.       Wu DY, Ugozzoli Л, Pal BK, Qian Ж, RB Wallace.  Влияние температуры и длины праймера олигонуклеотида на характерности и эффективность амплификации цепной реакцией полимеразы.  Biol Клетки ДНАА. 1991 Apr;10(3):233-8.
16.       Strachan, Т; Прочитайте A.P; Людская Молекулярная Генетика 2. 1999. Раздел 1 Главы 6 John Wiley & Сынков Inc..
17.       Scharf S Ж; Рожочок G Т; Erlich Ю. A Сразу анализ клонирования и последовательности ферментационно усиленных genomic последовательностей. Наука, 1986 Сентябрь 5, 233(4768):1076-8.
18.       Cline Ж, Braman JC, Hogrefe HH; Точность воспроизведения PCR полимеразы ДНАА pfu и других термостабильных полимераз ДНАА.  Нуклеиновые Кислоты Res. 1996 сентябрь 15;24(18):3546-51.
19.       Falooea, F, Weiss, S, Ferre, F, Mullis, К. 1990 6-ых Int.Conf. AIDS. Abstr.
20.       Д’Aquila, R.T., Bechtel, L.J., Videler, J.A, Eron, J.J., Goeczyca, P, Kaplan, J.C. 1991.  Нуклеиновые Кислоты Res. 19:3749.
21.       Dang Ч, Jayasena Sd. Иы АБС битор олигонуклеотида полимеразы ДНАА Taq облегчают обнаружение низких целей номера экземпляра ПЧР. Mol Biol Ж. 1996 ноябрь 29;264(2):268-78.
22.       Kellogg De, Rybalkin Ii1, Chen С, Mukhamedova Н, Vlasik Т, Палладиум Siebert, Chenchik A ТацСтарт Антитело: "горячий старт" PCR облегченный нейтрализуя моноклональным антителом направил против полимеразы ДНАА Taq. Biotechniques. 1994 Jun;16(6):1134-7.
23       Mb Kermekchiev, Tzekov А, Barnes WM. Холодн-cuvstvitel6nye мутанты полимеразы ДНАА Taq обеспечивают горячий старт для PCR. Нуклеиновые Кислоты Res. 2003 ноябрь 1;31(21):6139-47.
24       H Li, У.Б. Гылленстеин, X Чуи, Р.К. Саики, H Еюрличю, и N Арнюеим. (1988). Амплификация и анализ последовательностей ДНАА в одиночной людской сперме и диплоидной природе 335 клеток: 414-417.
25.       Barnes WM.; Амплификация PCR до ДНАА 35-kb с точный и высокого выхода от шаблонов бактериофага lambda. Proc Natl Acad Sci У С А. 1994 март 15;91(6):2216-20.
26.       Амплификация Cheng с, Fockler ч, Barnes WM, Higuchi R Эффективн длинних целей от клонированных вставок и людское genomic ДНАО. Proc Natl Acad Sci У С А. 1994 июнь 7;91(12):5695-9.
27.       Caruthers Mh, ОБЪЯВЛЕНИЕ Barone, Beaucage Sl, Dodds Dr, Fisher EF, McBride LJ, Matteucci М, Stabinsky З, Tang JY.  Химически синтез deoxyoligonucleotides методом phosphoramidite.  Методы Enzymol. 1987;154:287-313.
28.       Beattie килолитр, Logsdon NJ, anderson RS, Espinosa-Lara JM, Малдонадо-maldonado-Rodriguez р, технология синтеза гена заморозка JD 3-его: новейшаяа разработка и будущие перспективности. Biochem Biotechnol Appl. 1988 Dec;10(6):510-21.
29.       Мосты Cg. Olga -- программа конструкторских работ праймера олигонуклеотида для st Atari.  Comput Appl Biosci. Apr;6(2):124-5 1990.
30.       Rozen с, Skaletsky H Примерэ на WWW для вообще потребителей и для программников biologist. Mol Biol Методов. 2000;132:365-86.
31.       World wide web положения: поиск http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed: “PCR”
32.       Vincent м, Xu ы, амплификация ДНАА H Kong Юеличасе-zavisima4 изотермическая. Представитель EMBO. 2004 Aug;5(8):795-800. Epub 2004 Июль 09.           
33.       Паыль Rabinow. Делать PCR, рассказ биотехнологии, университета давления chicago, 1996