Рекомбинатное выражение протеина

Станция 2006 © авторского права молекулярная

Когда вы хотите характеризовать ген или протеин интереса, вы должны сперва изучить свою функцию. В этой молекулярной эре, получать cDNA вашего гена интереса не трудн.

Выразить cDNA как протеин, ie. рекомбинатный протеин, одно может после этого легко выполнить функциональные изучения используя рекомбинатный очищенный протеин.

Как только вы имеете очищенный протеин вы можете дирижировать:

• эксперименты по взаимодействия Протеин-протеина
• Кинетика энзима
• Функциональные изучения протеина
• Структурные изучения - включая кристаллизацию протеина, структуру протеина и НАЦИОНАЛЬНЫЙ ВОЕННЫЙ ПРЕДСТАВИТЕЛЬ.
• Вы можете также использовать протеин для того чтобы сделать антитела для более дополнительных экспериментов.

2 главным образом системы для выражения рекомбинатного протеина. Как только вы получаете ваше cDNA клонировано, вы должны решить где вы хотите усилить ваш протеин. Это будет или prokaryotic (бактериально) или eukaryotic (обычно системой дрождей или mammalian клетки). Выбор вашей системы решит который вектор вам будет нужно клонировать ваше cDNA в по мере того как различные промоутеры которые действуют в Escherichia Coli и другие которые работают наиболее наилучшим образомнаилучшим образом с дрождями или mammalian системами.

Так которая система выражения протеина будет вы использовать?

 Системы для выражения протеина

Prokaryotic системы выражения протеина

Prokaryotic рекомбинатные системы выражения протеина имеют несколько преимуществ. Эти включают легкость культуры, и очень быструю смысль роста клетки вы ждать длиной для того чтобы получить протеин от бактериальных систем как только вы клонируете ваше cDNA. Выражение можно навести легко в бактериальных системах выражения протеина используя IPTG. Также, очищение довольно просто в prokaryotic системах выражения и избыток коммерчески наборов имеющихся для рекомбинатного выражения протеина.

С другой стороны, если вам нужно использовать ваши протеины для функциональных или ферментационных изучений, то prokaryotic системы проблема по мере того как большинств протеины будут неразрешимыми в телах включения и очень трудны для того чтобы взять как функциональные протеины. Furthermore, большая часть если не все столб-поступательные изменения не добавлены бактериями и поэтому вашим протеином интереса, то не может быть функциональна. Ферментационные изучения таким образом могут быть малоплодовы.

Eukaryotic системы выражения

Eukaryotic гены нет действительно «на дому» в prokaryotic клетках, даже когда они выражены под контролем prokaryotic векторов.  Одна причина что клетки Escherichia Coli часто узнают продукты протеина клонированных eukaryotic генов как аутсайдеры и разрушают их.  Другое что prokaryotes не уносят такие же виды изменения posttranslational какие eukaryotes делают.  Например, протеин который обычно был бы соединен к сахарам в eukaryotic клетке будет выражен как чуть-чуть протеин клонировано в бактериях.  Это может произвести эффект деятельность при или стабилность протеина, или хотя бы своя реакция к антителам.  Больше серьезной проблемы что интерьер бактериальной клетки нет как благоприятно к правильной складчатости eukaryotic протеинов как интерьер eukaryotic клетки.  Часто, результат неправильно сложен, бездействующие продукты клонированных генов. 

Eukaryotic системы для выражения протеина включают:

• дрожди
• mammalian клетки
• клетки baculovirus (насекомое)

Все эти системы большие eukaryotic системы для выражения рекомбинатных протеинов.
Преимущества eukaryotic систем выражения протеина включают факт что вы можете получить очень высокии уровни выражения. Протеины легки для того чтобы очистить используя специальные бирки которые включенны в векторы включая его, Myc и другие бирки.

Вы можете даже закупить плазмиды которые делают ваш протеин секретным в средства. Поэтому вы можете держать вырасти ваша система и собрать средства без лизировать ваши клетки. Никакие тела включения, котор нужно потревожиться около и ваши протеины имеют неповрежденные столб-поступательные изменения. Эти существены если вы изучаете функцию взаимодействий протеина and/or протеин-протеина.

Недостатки eukaryotic систем выражения протеина включают факт что eukaryotic клетки растут более медленными чем prokaryotic клетки.

Векторы выражения с сильными промоутерами

Главным образом функция вектора выражения производить продукт гена обычно, больше продукт лучшее.  Поэтому, векторы выражения обычно оборудованы с очень сильными промоутерами; рассуждение что больше mRNA произведен, будет сделано больше продукт протеина.
Один такой сильный промоутер промоутер trp (operon триптофана).  Оно формирует основу для нескольких векторов выражения, включая ptrpL1.  Оно имеет зону промоутера/оператора trp, быть последованным за связующим сайтом рибосомы, и может быть использован сразу как вектор выражения путем вводить чужой ген в место ClaI. Альтернативно, зона управлением trp может быть сделана «портативной машинкой» путем резать ее вне с ClaI и HindIII и вводить ее перед геном, котор нужно выразить в другом векторе

Индуцибильные векторы выражения

Обычно выгодно держать клонированный ген represed до тех пор пока мы не будем готовы выразить его.  Одна причина что eukaryotic протеины произведенные в больших количествах в бактериях могут быть токсическими.  Даже если эти протеины фактически не токсические, они могут построить до уровней auch больших что они мешают с бактериальным ростом.  И в том и в другом случае, если клонированный ген был позволен остать повернутым дальше постоянн, то не росли бы, что к большой достаточно концентрации произвели бактерии нося ген никогда содержательные количества продукта протеина.  Разрешение держать клонированный ген повернуто путем устанавливать его по потоку индуцибильного промоутера который можно повернуть.
Промоутер lac индуцибильн до известной степени, предположительно остающ до простимулировано синтетическим isopropylthiogalactoside inducer (IPTG).  Однако, репрессия причиненная репрессором lac незакончена, а некоторое выражение клонированного гена будет наблюдаться даже в отсутствии inducer.  One-way вокруг этой проблемы выразить наш ген в плазмиде или phagemid которое носит свой собственный ген lacI, по мере того как pBS делает.  Сверхнормальный репрессор произвел таким вектором держит наш клонированный ген повернуто до тех пор пока мы не будем готовы навести его с IPTG.
Другая стратегия использовать плотно контролируемый промоутер как промоутер PL λ фаговой. Векторы выражения с этой системой промоутера/оператора клонированы в ведущие ячейки нося temperature-sensitive ген репрессора λ (c1857).  Покуда мы держим температуру этих клеток относительно низким (32°C), репрессор действует, и никакое выражение не осуществляет.  Однако, когда мы повышаем температуру к nonpermissive уровню (42ºC), temperature-sensitive репрессор может никакая более длинняя функция и клонированный ген наведен.

Векторы выражения которые производят протеины сплавливания

Когда большинств векторы выражения работают, они производят протеины сплавливания.  Это могло вначале показаться недостатком потому что не сделан натуральный продучт введенного гена.  Однако, экстренные аминокислоты на протеине сплавливания могут быть большим подспорьем в очищать продукт протеина.

Рассматривайте векторы выражения oligo-гистидина, одно чего имеет pTrcHis коммерческого названи.  Эти имеют короткую последовательность как раз вверх по течению множественного места клонирования которое шифрует простирание 6 гистидинов.  Таким образом, протеин выраженный в таком векторе будет протеином сплавливания с 6 гистидинами на своем амино конце.  Почему мы хотели бы прикрепить 6 гистидинов к нашему протеину?  зоны Oligo-гистидина как это имеют высокое сродство для металлов как никель, поэтому мы можем очистить протеины которые имеют такие зоны используя хромотографию сродства никеля.  Красотка этого метода свои простота и скорость.  После того как бактерии делали протеин сплавливания, мы просто лизируем их, добавляем выдержку srude бактериальную к колонке сродства никеля, моем вне все unbound протеины, тогда выпускаем протеин сплавливания с гистидином или имидазолом гистидина сетноым-аналогов вызванным.  Эта процедура позволяет нам сжать существенно чисто сплавливание в только одном шаге.  Это возможно потому что очень несколько если любые естественные протеины имеют зоны, то oligo-гистидина, поэтому наш протеин сплавливания существенно единственное одно то связи к колонке.

Что если мы хотим наш протеин -, то освобождают бирки oligo-гистидина? 

Конструкторы этих векторов заботливо обеспечивали путь извлечь его.  Только перед множественным местом клонирования, зона кодирвоания для простирания аминокислот узнанных enterokinase протеолитического энзима.  Так мы можем использовать enterokinase для того чтобы расколоть протеин сплавливания в 2 части:  бирка oligo-гистидина и протеин мы хотим. Место узнанное enterokinase очень редко, и шанс что он существует в нашем протеине незначительн.  Таким образом, наш протеин не должен быть прерван вверх по по мере того как мы извлекаем свою бирку oligo-гистидина.  Если мы хотим, то мы можем побежать enterokinase-ый протеин через колонку никеля как только больше для того чтобы отделить oligo-hisitidine части от протеина интереса.

бактериофаги λ также послужили за основа для векторов выражения;  конструированное одно специфически в этой цели λgt11.  Этот бактериофаг содержит зону управлением lac последованную за геном lacZ.  Места клонирования расположены внутри ген lacZ, поэтому продукты гена введенного в этот вектор будут протеинами сплавливания с руководителем B-галактозидазы.
Вектор λgt11 выражения стал популярным кораблем для делать и экранировать архивы cDNA.  λgt11 позволяет нам экранировать группу в составе клоны сразу для выражения правого протеина.  Главные ингридиенты необходимы для этой процедуры архив cDNA в λgt11 и антисыворотка сразу против протеина интереса.
Мы покрываем наши бактериофаги λ с различными вставками cDNA и blot протеины выпущенные каждым клоном на поддержку как нитроцеллюлоза.  Как только мы переносили протеины от каждой металлической пластинкы к нитроцеллюлозе, мы зондируем с нашей антисывороткой.  Затем, мы ищем антитело прыгнутое к протеину от определенной металлической пластинкы, используя обозначенный протеин a от стафилококка - aureus.  Этот протеин связывает плотно к антителу и обозначает соответствуя пятно на нитроцеллюлозе.  Мы обнаруживаем этот ярлык радиоавтографией или путем phosphorimaging, тогда идем к нашей мастерской плите и выбираем соответствуя металлическую пластинку.  Заметьте что мы обнаруживайте протеин сплавливания, не протеин самого интереса.  Furthermore, он не имеет значение если мы клонировали все cDNA или не.  Наша антисыворотка смесь антител которые прореагируют с несколькими различных частей нашего протеина, настолько даже частично ген сделает, покуда своя зона кодирвоания будет клонирована в такой же рамке ориентации и чтения как зона кодирвоания B-галактозидазы.

Для быстрого рекомбинатного просмотрения выражения протеина см.:

Рекомбинатные системы протеина

Станция 2006 © авторского права молекулярная