Добро пожаловать к молекулярной станции!

Вы должны зарегистрировать прежде чем вы можете вывесить на наши форумы или использовать наши предварительные характеристики. Регистр Теперь! Свои свободно и быстро!

Уже зарегистрировано? Login теперь ниже.

Имя Потребителя:

Пароль:

Вспомните Меня?

Уже зарегистрировано и забыл ваш пароль? Click ниже, котор нужно взять его.

Возьмите Lost Пароль

Соедините теперь - он быстрый и свободно!

Молекулярной станцией будет самая большая сеть исследователей, научных работников и любовников науки где-либо!

Недавние Столбы Форума

Рекомбинатное Выражение Протеина

Станция © 2006 Авторского права Молекулярная

Когда вы хотите характеризовать ген или протеин интереса, вы должны сперва изучить свою функцию. В этой молекулярной эре, получать ДНАО вашего гена интереса не трудн.

Для того чтобы выразить ДНАО как протеин, ie. рекомбинатный протеин, одно может после этого легко выполнить функциональные изучения использующ рекомбинатный очищенный протеин.

Как только вы имеете очищенный протеин вы можете дирижировать:

• Эксперименты по Взаимодействия Протеин-proteina
• Кинетика Энзима
• Функциональные изучения протеина
• Структурно изучения - включая кристаллизацию протеина, структуру протеина и NMR.
• Вы можете также использовать протеин для того чтобы сделать антитела для более дополнительных экспериментов.

2 главным образом системы для выражения рекомбинатного протеина. Как только вы получаете ваше ДНАО после того как вы клонированы, вы должны решить где вы хотите усилить ваш протеин. Это будет или prokaryotic (бактериально) или eukaryotic (обычно система дрождей или mammalian клетки). Выбор вашей системы решит который вектор вы клонировать ваше ДНАО в по мере того как по-разному promoters действуют в E.Coli и другие работают наиболее наилучшим образом с дрождями или mammalian системами.

Так система выражения протеина будет вы использовать?

 Системы для выражения протеина

Системы Выражения Протеина Prokaryotic

Системы выражения протеина Prokaryotic рекомбинатные имеют несколько преимуществ. Эти вклюают легкость культуры, и очень быстро смысль роста клетки, котор вы ждать длиной для того чтобы получить протеин от бактериальных систем как только вы клонируете ваше ДНАО. Выражение можно навести легко в бактериальных системах выражения протеина использующ IPTG. Также, очищение довольно просто в prokaryotic системах выражения и будут избыток коммерчески наборов имеющихся для рекомбинатного выражения протеина.

С другой стороны, если вы использовать ваши протеины для функциональных или ферментационных изучений, то prokaryotic системами будут проблема по мере того как большинств протеины будут неразрешимыми в телах включения и очень трудны для того чтобы взять как функциональные протеины. Furthermore, большая часть if not все столб-postupatel6nye изменения не добавлена бактериями и поэтому ваш протеин интереса не может быть функциональн. Ферментационные изучения таким образом могут быть малоплодовы.

Системы Выражения Eukaryotic

Гены Eukaryotic не находятся реально “дома” в prokaryotic клетках, even when они выражены под управлением prokaryotic векторов.  Одна причина что клетки E coli част узнают продукты протеина клонированных eukaryotic генов как аутсайдеры и разрушают их.  Другое что prokaryotes не уносят такие же виды изменения posttranslational eukaryotes делают.  Например, протеин который обычно был бы соединен к сахарам в eukaryotic клетке будет выражен как чуть-чуть протеин после того как он клонирован в бактериях.  Это может произвести эффект деятельность при’или стабилность протеина с, или по крайней мере своя реакция к антителам.  Серьезная проблема что интерьер бактериальной клетки не как conducive к правильной складчатости eukaryotic протеинов как интерьер eukaryotic клетки.  Част, результат неправильно сложен, бездействующие продукты клонированных генов. 

Системы Eukaryotic для выражения протеина вклюают:

• дрожди
• mammalian клетки
• клетки baculovirus (насекомое)

Всеми этими системами будут большие eukaryotic системы для выражения рекомбинатных протеинов.
Преимущества eukaryotic систем выражения протеина вклюают факт что вы можете получить очень высокие уровни выражения. Протеины легки для того чтобы очистить использующ специальные бирки включенны в векторы включая его, Myc и другие бирки.

Вы можете даже закупить плазмиды делают ваш протеин секретным в средства. Поэтому вы можете держать вырасти ваша система и собрать средства без лизировать ваши клетки. Не будут тел включения, котор нужно потревожиться около и ваши протеины имеют неповрежденные столб-postupatel6nye изменения. Эти существены если вы изучаете функцию взаимодействий протеина and/or протеин-proteina.

Недостатки eukaryotic систем выражения протеина вклюают факт что eukaryotic клетки растут более медленными чем prokaryotic клетки.

Векторы выражения с сильными promoters

Главным образом функция вектора выражения должна производить продукт гена обычно, больше продукт лучшее.  Поэтому, векторы выражения обычно оборудованы с очень сильными promoters; рассуждение что больше mRNA произведено, будет сделано больше продукт протеина.
Один такой сильный promoter будет promoter trp (operon триптофана).  Оно формирует основу для нескольких векторов выражения, включая ptrpL1.  Оно имеет зону trp promoter/operator, быть последованным за связующим сайтом рибосомы, и может быть использован сразу как вектор выражения путем вводить чужой ген в место ClaI. Друг, зона управлением trp может быть сделана “портативным” путем резать его вне с ClaI и HindIII и вводить его перед геном, котор нужно выразить в другом векторе

Индуцибильные Векторы Выражения

Обычно выгодно держать клонированный ген represed до тех пор пока мы не быть готовы выразить его.  Одна причина что eukaryotic протеины произведенные в больших количествах в бактериях могут быть токсическими.  Even if эти протеины не фактическ токсические, они могут build up to уровни auch большие что они мешают с бактериальным ростом.  В любой случай, если клонированный ген был позволен остать повернутым дальше постоянн, то бактерии нося ген никогда grow to большая достаточно концентрация для того чтобы произвести содержательные количества продукта протеина.  Разрешение должно держать клонированный ген после того как я повернуто путем устанавливать его downstream of индуцибильный promoter можно повернуть.
Promoter lac индуцибильн до известной степени, presumably остающеся до после того как я простимулирован синтетическим isopropylthiogalactoside inducer (IPTG).  Однако, репрессия причиненная репрессором lac незакончена, и некоторое выражение клонированного гена будет наблюдаться даже в отсутствии inducer.  Одна дорога вокруг этой проблемы должна выразить наш ген в плазмиде или phagemid носит свой собственный ген lacI, по мере того как pBS делают.  Сверхнормальный репрессор произвел такими содержаниями вектора наш клонированный ген повернутый до тех пор пока мы не быть готовы навести его с IPTG.
Другой стратегией будет использование плотно контролируемого promoter как λ фаговой promoter pl. Векторы выражения с этой системой promoter/operator клонированы в ведущие ячейки нося температур-cuvstvitel6ny1 λ ген репрессора (c1857).  Как длиной по мере того как мы держим температуру этих клеток относительно низким (32°C), репрессор действует, и никакое выражение не принимает место.  Однако, когда мы повышаем температуру к nonpermissive уровню (42ºч), температур-cuvstvitel6ny1 репрессор может no longer не действовать и клонированный ген наведен.

Векторы выражения производят протеины сплавливания

Когда большинств векторы выражения работают, они производят протеины сплавливания.  Это могло на сперва показаться недостатком потому что не сделан натуральный продучт введенного гена.  Однако, экстренные амино кислоты на протеине сплавливания могут быть большой помощью в очищать продукт протеина.

Рассматривайте векторы выражения олиго-gistidina, одно из которых имеет pTrcHis фирменного названия.  Эти имеют скоро последовательность как раз upstream of множественное место клонирования шифрует простирание 6 гистидинов.  Таким образом, протеин выраженный в таком векторе будет протеином сплавливания с 6 гистидинами на своем амино конце.  Почему мы хотели бы прикрепить 6 гистидинов к нашему протеину?  зоны Олиго-gistidina как это имеют высокое сродство для металлов как никель, поэтому мы можем очистить протеины которые имеют такие зоны использующ хромотографию сродства никеля.  Красоткой этого метода будет своими простотой и скоростью.  После того как бактерии делали протеин сплавливания, мы просто лизируем их, добавляем выдержку srude бактериальную к колонке сродства никеля, моем вне все unbound протеины, тогда выпускаем протеин сплавливания с гистидином или имидазолом гистидина сетноым-аналогов вызванным.  Эта процедура позволяет нас сжать необходимо чисто сплавливание в только одном шаге.  Это по возможности потому что очень несколько если любые естественные протеины имеют зоны, то олиго-gistidina, поэтому наш протеин сплавливания необходимо единственное одним которое связывает к колонке.

Если мы хотим наш протеин свободно бирки олиго-gistidina? 

Конструкторы этих векторов заботливо обеспечивали дорогу извлечь ее.  Just before множественное место клонирования, будет зона кодирвоания для простирания амино кислот узнанных протеолитическим enterokinase энзима.  Так мы можем использовать enterokinase для того чтобы расколоть протеин сплавливания в 2 части:  бирка олиго-gistidina и протеин, котор мы хотим. Место узнанное enterokinase очень редко, и шанс что он существует в нашем протеине незначительн.  Таким образом, наш протеин не должен быть прерван вверх по по мере того как мы извлекаем свою бирку олиго-gistidina.  Если мы хотим, то мы можем побежать ентерокинасе-y1 протеин через колонку никеля once more для того чтобы отделить части oligo-hisitidine от протеина интереса.

λ бактериофаги также послужили за основа для векторов выражения;  одно конструированное специфически для этой цели будет λgt11.  Этот бактериофаг содержит зону управлением lac последованную за геном lacZ.  Места клонирования расположены внутри ген lacZ, поэтому продукты гена введенного в этот вектор будут протеинами сплавливания с руководителем Б-galaktozidazy.
Вектор gt11 λвыражения стал популярным кораблем для делать и экранировать архивы ДНАА.  λgt11 позволяет нас экранировать группу в составе клонирует сразу для выражения правого протеина.  Главные ингридиенты необходимы для этой процедуры будут архивом ДНАА в λgt11 и антисывороткой сразу против протеина интереса.
Мы покрываем наши λ бактериофаги с различными вставками ДНАА и blot протеины выпущенные каждым клоном на поддержку such as нитроцеллюлоза.  Как только мы переносили протеины от каждой металлической пластинкы к нитроцеллюлозе, мы зондируем с нашей антисывороткой.  Затем, мы look for антитело прыгнутое к протеину от определенной металлической пластинкы, использующ обозначенный протеин а от стафилококка aureus.  Этот протеин связывает плотно к антителу и обозначает соответствуя пятно на нитроцеллюлозе.  Мы обнаружили этот ярлык радиоавтографией или путем phosphorimaging, после этого идем к нашей мастерской плите и выбираем соответствуя металлическую пластинку.  Заметьте что мы обнаруживайте протеин сплавливания, не протеин самого интереса.  Furthermore, он не имеет значение если мы клонировали все ДНАО или не.  Наша антисыворотка будет смесью антител прореагируют с несколькими по-разному частей нашего протеина, настолько даже частично ген сделает, как длиной по мере того как своя зона кодирвоания клонирована в такой же рамке ориентации и чтения как зона кодирвоания Б-galaktozidazy.

Для быстро рекомбинатного просмотрения выражения протеина см.:

Рекомбинатные Системы Протеина

Станция © 2006 Авторского права Молекулярная