Assaying Взаимодействия Протеина ДНАА

Выучьте о как assay взаимодействия Дна-proteina.

Assaying Взаимодействия DNAProtein

4 важных метода для assaying взаимодействия Дна-proteina. Первые 2 метода (вязка фильтра и перенос удобоподвижности геля) обусловливают если ваше ДНАО взаимодействует с протеином. Другие 2 метода (dNase Footprinting и DMS Footprinting) показывают где место цели взаимодействия между протеином и ДНАОМ лежит на ДНАЕ.

Вязка Фильтра

Фильтры мембраны нитроцеллюлозы общ использованы для того чтобы filter-sterilize разрешения. Фильтры нитроцеллюлозы могут связать ДНАО, но только под некоторыми условиями. ДНАО Singlestranded связывает готово к нитроцеллюлозе, но ДНАО сели на мель двойником, котор собой не делает. С другой стороны протеин связывает, и если протеин прыгнут к double-stranded ДНАУ, то комплекс протеин-Dnaa свяжет. Пожалуйста refer to статья assay фильтра нитроцеллюлозы binding для больше информации.

Gel Перенос Удобоподвижности

Для того чтобы измерить взаимодействия Дна-proteina этот метод полагается на просто факте что малое ДНАО имеет гораздо высокее удобоподвижность в электрофорезе геля чем такое же ДНАО делает когда оно должно прыгнуть к протеину. Мы поэтому можем обозначить часть ДНАА вида сели на мель двойником, котор, тогда смешиваем ее с протеином, и electrophorese комплекс. После этого мы подвергаем гель в радиоавтографии для того чтобы обнаружить обозначенный вид. Малый размер ДНАА важн в этом assay. Если весь ген был использован, то своя удобоподвижность уже была бы очень низка, и перенос удобоподвижности причиненный вязкой протеина был бы трудн для того чтобы обнаружить. Поэтому мы должны знать приблизительно где протеин связывает к ДНАУ поэтому мы можем подготовить скоро часть ограничения, or even синтетический double-stranded олигонуклеотид который будет содержать место цели для протеина, но немного еще.

DNase Footprinting

Как только мы знаем что протеин связывает к, котор дали ДНАУ мы можем использовать footprinting для того чтобы найти вне где место цели лежит на ДНАЕ. Dnase footprinting полагается на факте что протеин, путем связывать к ДНАУ, покрывает связующий сайт и поэтому защищается его от нападения Dnase. В это чувство он оставляет "footprint" на ДНАО. Первыйа шаг в footprinting эксперименте конц-oboznacaet ДНАО. Мы можем обозначить любую стренгу, но только одно в эксперимент. Затем, мы связываем протеин к ДНАУ. После этого мы обрабатываем комплекс Дна-proteina с dnase iim под слабыми условиями (очень маленьким dnase), так, что средний только отрезанного одного произойдет в молекулу ДНАА. Затем, мы извлекаем протеин от ДНАА, отделяем стренги ДНАА, и electrophorese приводя к части на high resolution polyacylamide gel наряду с отметками размера. Части возникнут от другого конца ДНАА также, но мы не обнаружим их потому что они немечены. Мы всегда вклюаем управление с ДНАОМ одним (отсутствие протеина), и обычно используем больше чем одну концентрацию протеина поэтому мы можем увидеть постепенно пропаданием полос в зоне footprint что предохранение ДНАА зависит на концентрации добавленного протеина. Footprint представляет зону ДНАА защищенную протеином, и поэтому говорит нам где протеин связывает.

DMS Footprinting

Dnase footprinting дает хорошую идею положения связующего сайта для протеина, но dnase будет макромолекулой и будет поэтому довольно тупой аппаратурой для зондировать точные детали связующего сайта. Намеревается, то там может быть зазоры в взаимодействии между протеином и ДНАО которое dnase не приспосабливать в и поэтому не обнаружил бы. Сверх того, протеины ДНАА binding част беспокоят ДНАО в пределах binding зоны, передергивая двойной helix. Эти возмущения интересны, но вообще не обнаружены Dnase footprinting потому что протеин держит dnase отсутствующим. Для того чтобы сделать более детальный footprinting, мы более малая молекула которая может поместить в nooks и трещины Дна-proteina сложного и показываем больше из subtleties взаимодействия. Любимейший инструмент для этой работы будет метилируя dimethylsulfate вещества (DMS).

При DMS footprinting мы start off in the same way as в dnase footprinting, путем конц-oboznacat6 ДНАО и вязку протеин. После этого мы метилируем комплекс Дна-proteina с DMS, использующ слабую обработку так, что на среднем только одно метилирование даже произойдет в молекулу ДНАА. Затем, мы dislodge протеин, и обрабатываем ДНАО при реагент который извлекает метилированные пурины, создавая apurinic места (deoxyriboses без оснований) на ДНАЕ. После этого мы ломаем ДНАО на этих apurinic местах. Эти реакции этими же как ДНАО Maxam-Gilbert sequencing реакции. Окончательно мы electrophorese части и autoradiograph ДНАА гель для того чтобы обнаружить обозначенное ДНАО соединяем. Каждая полоса кончается рядом с нуклеотидом был метилирован и таким образом unprotected протеином.

См. молекулу ДНАА в 3-Dimensions

bioinformatics днаа