Bioinformatics, Протоколы, Протеин Proteomics RNA ДНАА

Протоколы Bioinformatic Биологии Домашние Оборудуют Encyclopaedia Биологии Форумов Биологии Молекулярный Молекулярные Изображения Биологии, котор Bookmark Мы!

домашн > днао > чдна-klonirovanie > index.php

Исследование Proteomics Протеина RNA ДНАА Videos Науки Новостиа науки Молекулярной Биологии Домашнее БЕТА! Методов биологии оборудования лаборатории Bioinformatics продукты биологии молекулярных молекулярные и соединения биологии обслуживаний родственные

Молекулярная Биология Blog

Пошлите эту страницу к другу

Внутриклеточные Станции

Буферов буферов ботаники антитела обломоки PCR в реальном масштабе времени PCR RNAi Microarray протеина Proteomics пептида воображения микробиологии массового спектрометрирования иммунологии Microarrays гистологии биологии клетки bookstore общих алфавитные и электрофореза геля культуры молекулярные и помарка Transfection биологии стержневой клетки SiRNA западная

 

Протоколы ДНАА

Энциклопедия ДНАА

ДНАО Bioinformatics

Форум ДНАА

ДНАО Blog

Весточка ДНАА

Книги ДНАА

 

Клонирование ДНАА

Выучьте о клонировании ДНАА.

Клонирование ДНАА

ДНАО (скоро для complemantary ДНАА или ДНАА экземпляра) будет экземпляром ДНАА RNA, обычно mRNA. Иногда мы хотим сделать архив ДНАА, комплект клонируем reprensenting так много как по возможности mRNAs в, котор дали типе клетки в данное время. Такие архивы могут содержать 10 тысяч по-разному клонируют. Другие времена, мы хотим сделать одно определенное aclone днаа содержа экземпляр ДНАА как раз одного mRNA. Этот метод, котор мы используем зависит в части на из эти цели мы желаем достигнуть.

Архивы ДНАА

Если мы хотим построить архив ДНАА, то мы можем использовать просто но эффективная стратегия которое полагается на отростчатом вызванном переводе забоины. Сутью перевода забоины будет одновременное удаление ДНАА впереди забоины (, котор одиночн-seli на мель пролома ДНАА) и синтеза ДНАА за забоиной. Чистыйа результат должен двинуть, или переведите забоину в ' направление 5'-3. Энзим, котор мы обычно используем перевод забоины будет полимеразой iim ДНАА E.coli, которая имеет ' деятельность при exonuclease 5'-3 которая позволяет энзим ухудшить ДНАО впереди забоины по мере того как она двигает вперед.

Центральной частью любая процедура по клонирования ДНАА будет синтез ДНАА от шаблона mRNA использующ обратное transcriptase. Обратное transcriptase как любой другой Дна-sinteziru4 энзим что оно не может начать синтез ДНАА без праймера. Для того чтобы получить вокруг этой проблемы, мы take advantage of кабель poly(A) на э'-konqax большинств eukaryotic mRNAs и используем oligo(dT) как праймер. Oligo(dT) комплементарно к poly(A), поэтому оно связывает к poly(A) на э'-konqax mRNA и воспламеняет синтез ДНАА, использующ mRNA как шаблон.

После того как mRNA было скопировано, производя, котор одиночн-seli на мель ДНАО ("первую стренгу"), мы частично ухудшаем mRNA с рибонуклеазой ю (рНКазой ю). Этот энзим ухудшает стренгу RNA гибрида RNA/DNA как раз мы для того чтобы начать усваивать RNA от нашего первого ДНАА стренги. Остальные части RNA служят по мере того как праймеры для делать "вторую стренгу," использующ первое как шаблон. Это будет участок забоин-perevoda процесса и снова, полимераза ii1 ДНАА E coli будет энзимом, котор мы используем унести реакцию забоин-perevoda. Чистыйа результат будет double-stranded ДНАО с малой частью RNA на щ'-konqax второй стренги.
Наша следующая задача должна перевязать ДНАО к вектору. Это было легко при наши части genomic ДНАА ые с энзимами ограничения, но DNAS не имеют никакие липкие концы. Мы можем перевязать тупые концы совместно, даже если то будет относительно неработоспособный процесс. Однако, если мы хотим эффективную перешнуровку позволянную липкими концами, то мы можем лавировать липкими концами (oligo[dC ]) на ДНАО, использующ вызванный энзим терминальной трансферазой deoxynucleotidyl (TdT) или просто терминальной трансферазой и одним triphosphates deoxribonucleoside. В случае, мы используем dCTP. Энзим добавляет dCMPs, одно одновременно, к 3'-ends ДНАА. In the same way, мы прикрепляем концы oligo(dG) к нашему вектору и позволяем oligo (dC)s, котор нужно обжечь к oligo(dG)s. Это приносит вектор и ДНАО совместно в рекомбинатное ДНАО можно использовать сразу для преобразования. Низкопробный спаривать между кабелями олигонуклеотида сильн достаточно что никакая перешнуровка необходима перед преобразованием. Лигаза ДНАА внутри преобразованных клеток окончательно выполняет перешнуровку.

См. молекулу ДНАА в 3-Dimensions