Спонсируйте/Разрекламируйте & Соедините к нам & Свяжитесь мы & О нас & Помогите нам

Молекулярная Биология Blog

Недавние Столбы Форума

 

Антитела Polyclonal

Совсем о антителах polyclonal.

Внешния ресурсы Антитела Polyclonal Родственные - Протоколы:

• Западная Помарка
• Immunoblot
• Иммунопреципитация (Ip)
• Творение антител использующ пептиды

Также станция антитела посещения для больше на антителах Polyclonal. Это будет новым местом перечисляет поставщиков антитела, учит о антителах, и протоколах.

Протоколы антитела Polyclonal:

• Иммунизируя Мыши
• Подготовка сыворотки от крови
• Иммунизирование Кролика
• Процедура по кровотечения кролика
• Получать сыворотку
• Высыпание сульфата аммония IgG от сыворотки
• Иммунизирование
• Протокол ELISA для скрининга антитела Polyclonal

Антитело Polyclonal

 

Антитела Polyclonal будут антителами выведенными от много Б-kletok или линий Б-kletki, подобных к смеси антител найденных в сыворотках крови.

Антитела Polyclonal будут поэтому смесью много по-разному характерностей антитела.

Закупленными подготовками антитела Polyclonal будут смеси антител много по-разному характерностей к такому же антигену.

Иммунизирование кролика, мыши, козочки, цыпленка, или другого животного производит антитела polyclonal. Животные сыворотки можно использовать сразу, тем ме менее более лучшее очистить антитела polyclonal для использования лаборатории.

Подготовка Антитела Polyclonal

Основано на протоколе Др. Давидом Боштелл

Иммунизирование мышей:

Впрыски для того чтобы иммунизировать мышей для поколения антител polyclonal должны быть сделаны на интервалах по крайней мере 2 неделей отделенным.

Following 2 адъюванта успешно:

• Адъювант Freund и адъювант MPL+TDM (РИБИ ИммуноЧюем Исследование, Inc.). Mpl более менее опасн чем первый адъювант.

1. Для первой впрыски иммунизирования: впрысните от 15 до 50 ug если антиген в адъюванте ul 200, впрыснутом subcutaneously.
2. Вторая впрыска должна произойти 2 недели более поздно; Вы должны после этого форсировать с от 15 до 50 ug антигена в адъюванте. (если время позволяет, то форсируйте снова месяц более поздно).
3. От 7 до 10 дней более поздно кровоточат сыворотку мыши и испытания использующ assay будет использован для скрининга. Если титр не достаточн высокий, то подталкивание снова через 2 недели после ранее подталкивания.

ВЕРХНЯЯ ЧАСТЬ

Подготовка Сыворотки:

1. После собирать, кровь должна быть позволена свернуться на 60 минут. на 37°C или O.N на 4°C.
2. Отделите сгусток крови от сторон пробки (звенеть) используя пипетку pasteur. Установьте сгусток крови на 4°C O.N.
3. Закрутите на 10000 х г на 10 MIN на 4°C для того чтобы отделить сыворотку.
4. Сыворотка можно хранить на -20°C после добавлять глицерол до 50%.

Если моноклонально антитела пожеланы, то как только вы имеете "хорошее" polyclonal и надежный метод скрининга продолжать к следующему шагу.

ВЕРХНЯЯ ЧАСТЬ

Кролики:

Иммунизируют кроликов необходимо как описано выше. Впрыски:

1. Во первых в впрыске 100-200ug/1ml Freund's вполне, 2 места (над каждым плечом).
2. Во-вторых 1 месяц более поздно в Freund's НЕПОЛНОМ как выше.
3. Кровотечение 2 недели более поздно. Подталкивание 2 недели более поздно снова (цикл 2 + 2 неделей).

ВЕРХНЯЯ ЧАСТЬ

 

ПРОДУКЦИЯ АНТИТЕЛ POLYCLONAL В КРОЛИКАХ (БЕЛИЗНЕ NEUSEELAND)

Основано на протоколе Др.Шалтер Steffen.

Кролики должны быть 3-4 килограмм в весе и около 3 месяцах старых. О трети кролика имейте эндогенные антитела и immunoactivity анти-keratina для various other клетчатых компонентов. Это подчеркивает важность принимать пре-immunnuh сыворотку от любого, котор дали кролика.

Буфера и разрешения:

• Насыщенное разрешение сульфата аммония, ЭТИЛЕНДИАМИНТЕТРАЦЕТАТ 2 миллиметров, pH 8.0
• 50 миллиметров ацетата аммония, pH 8.0
• этанол 70%
• Адъювант Freund's (вполне & неполно)
• Saline амортизированное фосфатом (PBS) (см. ниже)
• Вазелин
• Ксилол

ВЕРХНЯЯ ЧАСТЬ

• Принесите кролика от своей клетки и установьте его обеспеченно в задерживая коробке покидая ухо доступной. Держите затишье кролика относительно. Тома крови up to 50 ml можно легко собрать от главной артерии вниз с центра надфюзеляжной поверхности уха.
• Побрейте левое ухо вокруг левой вены с свежей бритвой.
• Вытрите тампоном ухо с этанолом или isopropanol 70%.
• Вытрите тампоном ухо с ксилолом вокруг петли артери-veny для того чтобы растянуть.
• Держите конец уха (твердо) и пробки собрания в одной руке и с свободно вставкой руки подкожная игла 19G в растягиванную артерию. Кровь должна начать пропускать немедленно в пробку собрания. Для самых лучших результатов используйте часть артерии mid-way вдоль уха.
• Соберите up to 50 ml крови. Придайте давление как раз anterior к пункту входа иглы к кровотечению стопа.
• Приложите вазелин к уху для того чтобы успокоить раздражение ксилола.
• Оденьте в экстренный вазелин отрезок.

Получать Сыворотку:

ВЕРХНЯЯ ЧАСТЬ

• Пробка свирли с собранной кровью для того чтобы покрыть поверхность и предотвратить приложение сгустка крови к пробке.
• Инкубируйте на oC 37 на 1 час.
• Центрифугуйте на 2.500 г (устанавливая #7 в клинической верхней части таблицы) на 10 минут.
• Извлекайте сгусток крови и закрутите сыворотку на 3.000 г на 10 минут.
• Сыворотка следует сохранить после того как я замерла.

Высыпание сульфата аммония IgG от сыворотки (oC 4, снесенного вне в холодную комнату):

Высыпание сульфата аммония будет легким методом для того чтобы получить справедливо чисто часть IgG.

ВЕРХНЯЯ ЧАСТЬ

• Сыворотка бассеина от одного кролика
• Сыворотка веса
W1 = _____ г
• Пробки мытья с минутой. PBS и весят снова.
W2 = _____ г
• Добавьте 2/3 томов насыщенного W2 сульфата аммония, ЭТИЛЕНДИАМИНТЕТРАЦЕТАТА 2 миллиметров, pH 8.0
Примечание: добавьте очень медленно, dropwise пока шевелящ на oC 4 или используйте перистальтический насос.
• Пошевелите на 15 минут.
• Переход к пробкам центробежки 40 ml; beaker мытья с 3 частями PBS: 2 части сульфат аммония и добавляет к пробкам.
• Закрутка на 12.000 г (Beckman JA-20: 10.000 rpm) на 10 минут.
• Сбросьте супернатант.
• Ресуспензируйте лепешку в PBS [ 1/2 W1 = VOL 1/2. ].
• Закрутите на 12.000 г на 10 минут, сбросьте лепешку.
• Соберите супернатант в beaker, стенах мытья с PBS.
Обусловьте w3 = _____
• Добавьте 2/3 VOL. Насыщенный w3 сульфат аммония, пока шевелящ. Продолжайтесь пошевелить на 15 минут.
• Перенесите подвес к пробкам центробежки 40 ml, пробку мытья с разрешением сульфата PBS/ammonium.
• Закрутите на 12.000 г на 10 минут.
• Сбросьте супернатант.
• Ресуспензируйте лепешки в 1/я W1 PBS.
• Сделайте диализ против PBS, 3-times 6 часов по каждому.
• Положите сыворотку в градуированную пробку, мешок диализа rinse наилучшим образом с PBS.
• Принесите up to 1/2 W1 = VOL 1/2 в PBS.
• Обусловьте концентрацию и аликвот протеина для хранения. Измерьте абсорбциу на 280 nm. Абсорбциа 1 разрешения mg/ml IgG приблизительно 1.5.

Иммунизирование:

ВЕРХНЯЯ ЧАСТЬ

• Растворите антиген ~400-600 г (~200-300 г в впрыску) в 2.2 ml 50 миллиметров ацетата аммония, буфера pH 8.0 или другого соотвествующего. Концентрация зависит на антигенности протеина, котор нужно впрыснуть.
• Количество антигена необходимо для того чтобы иммунизировать животное зависит на ем антигенность и метод иммунизирования. Если протеины с низкой антигенностью использованы, то будет полезно денатурировать протеин с низкой концентрацией sds (up to 0.2%). Только высоки очищенный антиген должен быть использован для продукции антител polyclonal. Легкий метод для того чтобы получить чисто антиген СДС-ПАГЕ. Протеины можно перенести к листу нитроцеллюлозы, запятнать с Ponceau с, cut out с бритвой, и использовать как антиген (look for стандартные протоколы в SDS-PAGE).
• Draw up адъювант 1.1.ml Freund's вполне с подкожной иглой 20G, тогда draw up 1.1 ml разрешения антигена. Замерзните остальные 1.1 ml для подталкивания.
• Держащ плунжер немобильным, извлекайте иглу и прикрепите стерильный stopcock 3-way.
• Смешайте антиген с адъювантом путем прикреплять второй стеклянный шприц к stopcock и впрыскивать back and forth. (предосторежение: некоторые пластичные шприцы могли прореагировать с минеральным маслом.)
• Вполне эмульсия будет сформирована после около 20-30 минут; показано довольно неожиданным увеличением в выкостности разрешения.

Предосторежение: будьте уверен что установка обеспеченная!
• После смешивая ожидания около за 20 минут до впрыски к управлению что смесь закончена (если неполно, масло отделится).
• Побрейте назад кролика от лезвий плеча к pelvis.
• Очистьте назад с этанолом или isopropanol 70%
• Впрысните под кожей в около 10-20 сторон вдоль позвоночника между лезвием плеча и pelvis использующ подкожную иглу 21G. (примечание: Первая впрыска через одну неделю после последнего кровотечения preimmune).
• Ждите один месяц и форсируйте с смесью антигена и неполного адъюванта. Избегите шрамов от ранее впрыски.
• Кровоточите после одной недели для того чтобы проверить для иммунн-reakqii. Подталкивание должно быть повторено, если иммунная реакция была слишком слаба; однако, по-разному кролик должен быть выбран, если кролик не прореагировал на всем /LI >

Справки: Garvey, J.S., Cremer, N E, & Sussdorf, D.h. (1977) В: Методы в иммунологии. Издание. Бенжамин/Чуммингс Publishing Компания. Масса Чтений. pp 545

ВЕРХНЯЯ ЧАСТЬ

Скрининг антитела Polyclonal использующ assay ELISA

Протокол ELISA для экрана антитела:

Материалы для ELISA:

плиты ° - 96 добро Dynatech Immulon, тип 2. (fisher 17-0221-199).

° PBS, TBS

° PBS + 0.1% твена 20 или TBS + 0.1% твена 20.

° преграждая разрешение = 2% BSA (тип v) в PBS. (добавьте 0.02% азоида для более длиннего хранения.)

буфер Elisa ° = 2% BSA + 0.1% твена 20 в PBS (азоиде опционном).

антитело ° = пероксидаза соединенные энзимом 1 хрена

субстрат ° = ABTS - 100X (от Zymed 00-2001)1

буфер ° HRP: кислота магния pH 4.2($$ET-490 цитрата na 100mM лимонная + цитрат na магния 720

двугидрат + 50 ml H2ЈO, pH 4.2).

перекись водопода 30% ° (1000X)

ВЕРХНЯЯ ЧАСТЬ

Протокол ELISA для антитела Polyclonal

1) ADSORBTION АНТИГЕНА

a) Dilute ag до 10 ug/ml в PBS.

б) добавляет ul 100 разрешения ag к каждому наилучшим образом.

разрешение O.N ч) покрынное с wrap сарана, на 4°C.

2) ПРЕГРАЖДАТЬ

a) Ag мытья unbound путем переворачивать плиты и flicking добра сушит.

rinse б) путем добавлять PBS к каждому добро и переворачивать его снова (польза squirt бутылка).

повторение ч) rinse дважды.

д) добавляет ul 100 преграждать разрешение к каждому наилучшим образом, оставляет 1 час на температуру комнаты или O.N на 4°C.

3) ГЛАВНЫМ ОБРАЗОМ АНТИТЕЛО

a) Добавьте антитело, котор нужно испытать:

Sup клеток = ul 25, смешивает наилучшим образом путем pipeting up and down (10 времен).

сыворотка, асциты = 1:100 и serie 1/5 разбавлений. Сделайте разбавления в преграждать разрешение.

разрешение б) 1 час на температуре комнаты или O.N на 4°C.

4) ВТОРИЧНОЕ АНТИТЕЛО

a) Антитело мытья unbound 4 времени с PBS + 0.1% твена 20.

б) добавляет ul 100 антитела соединенного энзимом к всем добрам. Сделайте соотвествующие разбавления в буфере Elisa. (ex: HRP будет 2000X).

разрешение ч) 1 час на температуре комнаты или O.N на 4°C.

5) СУБСТРАТ

a) Субстрат Disolve в воде.

плита мытья б) 4 времени с PBS + 0.1% твена 20 (польза TBS вместо PBS для ap).

ч) добавляет ul 100 субстрата к каждому добру.

развитие цвета вахты д). Это было в состоянии принять от немного секунд до 20 минут.

е) если нужно, останавливает реакцию путем добавлять ul 50 naOH 4M.

абсорбциа ф) прочитанная в читателе Elisa на правильно длине волны (на система 416 nm HRP, для ap - 405 nm).

ВЕРХНЯЯ ЧАСТЬ

Другое Антитело Websites

См. станция антитело будет новым местом покрывает антитела, поставщиков антитела, и другую антител-rodstvennuh информацию.

Найдите другие антитело и отнесенные моноклональные темы антитела здесь: