Welcome to Molecular Station! Bine ati venit la Molecular Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Trebuie să te înregistrezi înainte de a putea posta pe forumuri sau de a utiliza caracteristicile avansate. Register Now! Înregistrează-te acum! Its Free and Fast! Libera si rapid!

Already registered? Ești deja înregistrat? Login now below. Login acum de mai jos.

User Name: Nume utilizator:

Password: Parola:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Ești deja înregistrat și V-ați uitat parola? Click below to recover it. Faceți clic mai jos pentru a le recupera.

Recover Lost Password Recuperare Parola uitata

Join now - it's fast and free! Inscrie-te acum - Este rapid și gratuit!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molecular Station este cea mai mare rețea de cercetători, oameni de știință și știință iubitori de oriunde!

Recent Forum Posts Recent Forum Posts

Bookmark Bookmark Site Bookmark Bookmark site

Cell Transfection Cell Transfection

This Transfection site is your portal for all things related to the transfection of cells with DNA plasmid or vector, RNA whether siRNA or RNAi, or even recombinant protein. Acesta este site-ul dvs. Transfection Portal pentru toate lucrurile legate de transfection a celulelor cu plasmida sau vector ADN, ARN sau dacă siRNA RNAi, sau chiar de recombinare a proteinelor. We provide you with all the background information, protocols for cell transfection, optimization and analysis steps, and cell transfection troubleshooting information to become the ultimate expert! Va oferim toate informațiile de fundal, protocoale de celule transfection, pași de optimizare și analiză, precum și de celule transfection informații de depanare pentru a deveni în final expert!

Transfection Table of Contents Transfection Cuprins

• What is transfection? Ce este transfection?
• Background Fond
• Applications Aplicatii
• Materials Materiale
• Transfection Methods Metode Transfection
• Buffers Buffers
  
• Preparation Pregătirea
• Protocol Protocol
• Other T ransfection Protocols Alte T ransfection Protocoale
• Discussion Topics for Transfection Subiecte de discutii pentru Transfection
• Get Help on your Transfection Problems Obțineți Ajutor privind dvs. Transfection Probleme
• Tips Sfaturi
• Storing Stocarea
• Troubleshooting In Transfection Rezolvarea problemelor În Transfection
• References Referinte

What is Transfection? Ce este Transfection?

Transfection describes the introduction of foreign material into eukaryotic cells using a virus vector or other means of transfer. Transfection descrie introducerea de materiale străine în eukaryotic cells, folosind un vector de virus sau alte mijloace de transfer.

The term transfection for non-viral methods is most often used in reference to mammalian cells, while the term transformation is preferred to describe non-viral DNA transfer in bacteria and non-animal eukaryotic cells such as fungi, algae and plants. Termenul transfection pentru non-virale metode este cel mai des folosite în referire la celule de mamifere, în timp ce termenul de transformare este de preferat pentru a descrie non-virale în bacterii ADN, de transfer și non-animală eukaryotic cells, cum ar fi ciuperci, plante și alge.

Transfection of animal cells typically involves opening transient pores or 'holes' in the cell plasma membrane, to allow the uptake of material. Transfection de celule animale implică de obicei deschiderea porilor tranzitorie sau "găuri" în membrana celulelor plasmatice, pentru a permite absorbției de materiale. Genetic material (such as supercoiled plasmid DNA or siRNA constructs), or even proteins such as antibodies, may be transfected. Material genetic (cum ar fi supercoiled plasmidă ADN sau construcții siRNA), sau chiar de proteine, cum ar fi anticorpi, pot fi transfected. In addition to electroporation, transfection can be carried out by mixing a cationic lipid with the material to produce liposomes, which fuse with the cell plasma membrane and deposit their cargo inside. În plus față de electroporation, transfection pot fi efectuate prin amestecul de o cationici lipide cu materialul pentru a produce liposomes, care a elementului de înlocuire a celulelor plasmatice, cu membrana de depozit și de marfă în interiorul lor.

The original meaning of transfection was 'infection by transformation', ie introduction of DNA (or RNA) from a eukaryote virus or bacteriophage into cells, resulting in an infection. Originalul a fost sensul transfection 'infecție de transformare ", și anume, introducerea de ADN (sau ARN) de la un virus sau eucariote bacteriophage în celule, rezultând într-o infecție. Because the term transformation had another sense in animal cell biology (a genetic change allowing long-term propagation in culture, or acquisition of properties typical of cancer cells), the term transfection acquired, for animal cells, its present meaning of a change in cell properties caused by introduction of DNA. Deoarece termenul de transformare a avut un alt sens în biologie animală, celule (o schimbare genetică, care să permită pe termen lung, raspandire, în cultură, sau achiziționarea de proprietăți tipice de celulele canceroase), termenul,, transfection dobândite, pentru animale de celule, sa prezinte sensul de o schimbare în celulă proprietăți cauzate de introducerea de ADN.

Transfection is a method by which experimental DNA may be put into a cultured mammalian cell. Transfection este o metoda prin care experimentale a ADN-ului pot fi puse intr-un cultivate celule de mamifere. Such experiments are usually performed using cloned DNA containing coding sequences and control regions (promoters, etc) in order to test whether the DNA will be expressed. Aceste experimente sunt, de obicei, efectuat cu clonate secvente de ADN care conțin de codificare și de control regiuni (promotori, etc) pentru a testa dacă a ADN-ului vor fi exprimate. Since the cloned DNA may have been extensively modified (for example, protein binding sites on the promoter may have been altered or removed), transfection is often used to test whether a particular modification affects the function of a gene. Deoarece ADN clonate putea să fi fost modificate pe larg (de exemplu, site-uri de legare de proteine pe promotorul putea să fi fost modificate sau eliminate), transfection este adesea folosit pentru a testa dacă un anumit modificare afectează în funcție a unei gene.

Transfection Diagram: Transfection Diagram:

Transfection Applications Cererile Transfection

The ability to synthesize RNA in the laboratory is critical to many techniques. Capacitatea de sintetizare ARN în laborator este deosebit de important, la mai multe tehnici. Radiolabeled and non-radiolabeled RNA probes are required for many protocols, and they can be synthesized easily in small scale in vitro transcription reactions allowing their use in blot hybridizations and nuclease protection assays. Radiolabeled și non-radiolabeled ARN probe sunt necesare pentru mai multe protocoale, și ele pot fi sintetizate în ușor de mici dimensiuni in vitro, reacții de transcriere care să permită utilizarea lor în blot hybridizations și de protecție a nuclease expertize.

Requirements for Transfection? Cerinte pentru Transfection?

• Vector or DNA Vector sau a ADN-ului
• Cells Celule
• Transfection Reagent Transfection Reactiv

Optimizing Transfection Optimizarea Transfection

In vitro transcription requires a purified linear DNA template containing a promoter, ribonucleotide triphosphates, a buffer system that includes DTT and magnesium In vitro, transcrierea nevoie de un șablon de purificat liniare de ADN care conține un promotor, ribonucleotide triphosphates, un sistem tampon, care include și magneziu DTT

Which Transfection Reagent to Use? Care Transfection Reactiv de utilizare?

In vitro transcription requires a purified linear DNA template containing a promoter, ribonucleotide triphosphates, a buffer system that includes DTT and magnesium In vitro, transcrierea nevoie de un șablon de purificat liniare de ADN care conține un promotor, ribonucleotide triphosphates, un sistem tampon, care include și magneziu DTT

Transfection Methods Metode Transfection

There are various methods of introducing foreign DNA into a eukaryotic cell. Există diferite metode de introducere a ADN străin într-o celulă eukaryotic. Many materials have been used as carriers for transfection, which can be divided into three kinds: (cationic) polymers, liposomes and nanoparticles. Multe materiale au fost folosite ca suport pentru transfection, care pot fi împărțite în trei tipuri: (cationic) polimeri, liposomes și nanoparticule.

One of the cheapest (and least reliable) methods is transfection by calcium phosphate, originally discovered by FL Graham and AJ van der Eb in 1973[citation needed] (see also [1]). Unul dintre cele mai ieftine (și puțin fiabile) metode este transfection de fosfat de calciu, descoperit inițial de către FL Graham și van der Eb AJ în 1973 [nevoie de citare] (vezi, de asemenea, [1]). HEPES-buffered saline solution (HeBS) containing phosphate ions is combined with a calcium chloride solution containing the DNA to be transfected. HEPES-soluție salină tamponată (HeBS) care conține ioni de fosfat este combinată cu o soluție de clorură de calciu care conțin ADN pentru a fi transfected. When the two are combined, a fine precipitate of the positively charged calcium and the negatively charged phosphate will form, binding the DNA to be transfected on its surface. Atunci când cele două sunt combinate, o amendă precipitatul de încărcat pozitiv și negativ de calciu fosfat de taxat va forma, cu caracter obligatoriu ADN pentru a fi transfected pe Suprafață. The suspension of the precipitate is then added to the cells to be transfected (usually a cell culture grown in a monolayer). De suspendare a precipitatul, apoi se adaugă în celule pentru a fi transfected (de obicei, o cultura de celule cultivate într-o monolayer). By a process not entirely understood, the cells take up some of the precipitate, and with it, the DNA. Printr-un proces nu în întregime de înțeles, celulele aibă acces la unele din precipitate, și cu ea, a ADN-ului.

Other methods use highly branched organic compounds, so-called dendrimers, to bind the DNA and get it into the cell. Alte metode de utilizare extrem de branched compuși organici, așa-numitele dendrimers, de a lega ADN si de a lua it în celulă. A very efficient method is the inclusion of the DNA to be transfected in liposomes, ie small, membrane-bounded bodies that are in some ways similar to the structure of a cell and can actually fuse with the cell membrane, releasing the DNA into the cell. O metodă foarte eficientă este de includere a ADN-ului pentru a fi transfected în liposomes, adică mici, membrana-organismele care sunt delimitate în unele moduri similare de a structura o celulă și pot de fapt, siguranțe cu membrana celulei, eliberați de ADN în celule . For eukaryotic cells, lipid-cation based transfection is more typically used, because the cells are more sensitive. Pentru eukaryotic cells, lipide-învățământul pe bază de transfection este utilizat de obicei mai multe, pentru ca celulele sunt mai sensibile.

Another method is the use of cationic polymers such as DEAE-dextran or polyethylenimine. O altă metodă este utilizarea de polimeri cationici, cum ar fi DEAE-dextran sau polyethylenimine. The negatively charged DNA binds to the polycation and the complex is taken up by the cell via endocytosis. Negativ de taxat pentru a ADN-ului se leagă de polycation și complexe este luată de către celule, prin intermediul endocytosis.

A direct approach to transfection is the gene gun, where the DNA is coupled to a nanoparticle of an inert solid (commonly gold) which is then "shot" directly into the target cell's nucleus. O abordare directă a transfection este arma de gene, în cazul în care ADN-ul este cuplat la o nanoparticle unei solide inerte (frecvent de aur), care este apoi "împușcat" direct în nucleul de celule țintă. DNA can also be introduced into cells using viruses as a carrier. ADN-ul poate fi, de asemenea, introduse în celule virusi, folosind ca un transportator. In such cases, the technique is called viral transduction, and, the cells are said to be transduced. În astfel de cazuri, tehnica este denumit viral transduction, și, celulele sunt menționate anterior pentru a fi transduced.

Other methods of transfection include nucleofection, electroporation, heat shock, magnetofection and proprietary transfection reagents such as Lipofectamine, Dojindo Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene or DreamFect. Alte metode de transfection includ nucleofection, electroporation, șoc termic, magnetofection și de proprietate transfection reactivi, cum ar fi Lipofectamine, Dojindo Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene sau DreamFect.

Stable vs Transient Transfection Methods Stabile vs tranzitorii Transfection Metode

For most applications of transfection, it is sufficient if the transfected gene is only transiently expressed. De cele mai multe cereri de transfection, este suficient dacă transfected de gene este doar transiently exprimate. Since the DNA introduced in the transfection process is usually not inserted into the nuclear genome, the foreign DNA is lost at the later stage when the cells undergo mitosis. Deoarece ADN-ul introdus in transfection proces nu este, de obicei inserate în genomul nuclear, a ADN-ului din străinătate, se pierde la etapă ulterioară, atunci când celulele sunt supuse mitosis. If it is desired that the transfected gene actually remains in the genome of the cell and its daughter cells, a stable transfection must occur. Dacă este de dorit ca gene transfected efectiv rămâne în genomul celulei de fiica sa și de celule, un grajd transfection trebuie să apară.

To accomplish this, another gene is co-transfected, which gives the cell some selection advantage, such as resistance towards a certain toxin. Pentru a realiza acest lucru, o altă genă este co-transfected, care oferă unele celule avantaj de selecție, cum ar fi o rezistență față de anumite toxine. Some (very few) of the transfected cells will, by chance, have inserted the foreign genetic material into their genome. Unii (foarte putini) din celule vor transfected, de sansa, au introdusa de material genetic străin în genomul lor. If the toxin, towards which the co-transfected gene offers resistance, is then added to the cell culture, only those few cells with the foreign genes inserted into their genome will be able to proliferate, while other cells will die. În cazul în care toxina, în care co-transfected oferte de gene de rezistență, apoi se adaugă în cultura de celule, doar cele câteva celule cu gene străine inserate în genomul lor vor putea să se prolifera, în timp ce alte celule vor muri. After applying this selection pressure for some time, only the cells with a stable transfection remain and can be cultivated further. După aplicarea acestei presiuni de selecție pentru o perioadă de timp, numai celulele cu o transfection rămân stabile și pot fi cultivate în continuare.

A common agent for stable transfection is Geneticin, also known as G418, which is a toxin that can be neutralized by the product of the neomycin resistant gene. Un agent de comune pentru Geneticin stabil transfection este, de asemenea, cunoscut ca G418, care este o toxina care pot fi neutralizate prin produsul a neomicin rezistente de gene.

Which Transfection Reagent or Method to Use? Care Transfection Reactiv sau Metoda se utilizează?

In vitro transcription requires a purified linear DNA template containing a promoter, ribonucleotide triphosphates, a buffer system that includes DTT and magnesium In vitro, transcrierea nevoie de un șablon de purificat liniare de ADN care conține un promotor, ribonucleotide triphosphates, un sistem tampon, care include și magneziu DTT

Tips for Transfection Sfaturi pentru Transfection

• Use RNAse inhibitors always! Utilizați întotdeauna RNAse inhibitori ai!
• Saving Money with T7 RNA Phage Polymerase: Clones with an N-terminal His-6 tag are available. Salvarea bani cu T7 ARN polimeraza Phage: Clonele cu un N-terminal Lui tag-6 sunt disponibile. If you obtain this clone, you can purify large amounts of T7 polymerase with high activity (ref: He B, Rong M, Lyakhov D, Gartenstein H, Diaz G, Castagna R, McAllister WT, Durbin RK. Protein Expr Purif. 1997, 9, 142–151). Dacă a obține acest clona, puteti purifica cantitati mari de T7 polimeraza cu un grad ridicat de activitate (REF: A B, Rong M, Lyakhov D, H Gartenstein, Diaz G, Castagna R, McAllister WT, RK Durbin. Protein expr Purif. 1997, 9, 142-151).
• To remove the DNA template, use an RNAse-free DNAse. Pentru a elimina ADN șablon, utilizați o RNAse-DNAse gratuit. We have used RQ1 DNase (Promega) added for 15 minutes and it works well. Am folosit RQ1 DNase (Promega) adăugată pentru 15 de minute și funcționează bine.

Storing Trasfection Reagent Stocarea Trasfection Reactiv

• RNA is best stored at a neutral pH with EDTA. ARN este cel mai bine păstrate la un pH neutru cu EDTA.
• TE buffer is recommended (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA), however this should be prepared with RNAse free purified (preferablly Millipore water). TE-tampon este recomandată (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA), totuși, acest lucru ar trebui să fie pregătit cu RNAse gratuit purificat (preferablly Millipore apa).

Troubleshooting Transfection Problems Rezolvarea problemelor Transfection Probleme

Failed Transfections Eșuare Transfections

• Old transfection reagent Casă transfection reactiv
• Improperly stored transfection agent Depozitate necorespunzător transfection agent de
• Poor quality DNA or vector Slaba calitate a ADN-ului sau vector
• Insufficient DNA amount Suma insuficientă a ADN-ului
• Insufficient transfection reagent Insuficiente transfection reactiv
• Too much DNA Prea mult a ADN-ului
• Too much transfection reagent Prea mult transfection reactiv

References on Transfection Trimiterile la Transfection

References on Transfection Trimiterile la Transfection

1. Bacchetti S, Graham F (1977). Bacchetti S, Graham F (1977). "Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA". "Transferul de gene pentru thymidine kinase kinase thymidine să-deficiente de celule umane purificat herpes simplex viral ADN-ului". Proc Natl Acad Sci USA 74 (4): 1590-4. Proc Natl Acad. Sci USA 74 (4): 1590-4. PMID 193108. PMID 193108.