home > protein > troubleshooting-western-blots > index.php home> proteină> depanare-vest-blots> index.php
 |
|---|
The Molecular Station Guide to Western Blotting Problems and Solutions: Common Western Blot Problems and Solutions for them! Molecular Station Ghidul pentru Western Blotting Probleme și soluții: Frecvente Western Blot Probleme și soluții pentru ei!
Please Contact Us with your ideas if you can add to this guide. Vă rugăm să ne contactați în legătură cu ideile dvs., dacă aveți posibilitatea să adăugați la acest ghid.
Membrane is Glowing in the Dark Room Membrana este Glowing in the Dark Room
High Background Inalta de fundal
Spots on Film Spoturi pe de Film
Too many Bands in Western Blot Prea multe Benzi de Vest Blot
Troubleshooting Western Blots Problem: Rezolvarea problemelor de Vest Blots Problema:
Spots on Film (missing bands) : Spoturi pe de Film (lipsesc trupe):
- Poor Transfer due to air bubbles during transfer to membrane -- Ajuta-Transfer datorită aerului bubbles în timpul transferului de membrana
- dirty film when adding to the developer -- Murdare de film, atunci când adăugarea de dezvoltator
- developer rolls are dirty -- Role de dezvoltator sunt murdare
Solution to spots on film: Solutie de a spoturilor de pe film:
- use a pasteur pipette as a roller. -- Să utilizeze un pasteur ca o pipetă de role. roll the membrane and gel before transfer to remove bubbles. rola de membrana si gel de transfer înainte de a elimina bubbles. keep membrane and materials wet. păstrează membrana umedă și materiale.
- keep film clean before adding to the developer -- Să păstreze curată de film înainte de a adăuga la dezvoltator
Troubleshooting Western Blots Problem: Rezolvarea problemelor de Vest Blots Problema:
Too Many Bands in Western Blot : Prea multe Benzi de Vest Blot:
- usually due to many non-specific bands -- De obicei, din cauza multe trupe ne-specifice
- poor primary antibody quality or old antibody -- Proasta calitate de anticorpi primari sau vechi anticorp
- not enough blocking -- Nu este suficient de blocare
- proteolytic cleavage of antigen - all additional bands are lower MW than your protein, ( ie your protein is being detected but was degraded) -- Proteolitice cleavage de antigen - toate benzile suplimentare sunt mai mici decât MW dvs. de proteine, (adică dvs. de proteine este în curs de detectat, dar a fost degradate)
Solutions to too many bands on western blot: Solutii la prea multe benzi de pe western blot:
- purchase another antibody or replace with a fresh antibody stock -- Cumpărarea unui alt anticorp sau să o înlocuiască cu un anticorp proaspete de stoc
- block with 5% dry non-fat milk or BSA prior to adding primary. -- Bloc cu 5%, uscată fără grăsime de lapte sau BSA înainte de adăugarea de primar. If you are already blocking, consider blocking during primary and secondary antibody incubations and also increasing blocking milk or BSA concentration. Dacă sunteți deja de blocaj, să ia în considerare în timpul de blocare primare și secundare de anticorpi incubations și, de asemenea, creșterea blocarea lapte sau BSA concentrare.
- keep everything on ice, use fresh samples, store in - 80C, and use protease inhibitors such as PMSF -- Să păstreze totul pe gheata, utilizează probe în stare proaspătă, în magazin - 80c, și de a folosi inhibitori de protează, cum ar fi PMSF
Troubleshooting Western Blots Problem: Rezolvarea problemelor de Vest Blots Problema:
High background; low signal to noise ratio on Western Blot High fundal; redus de semnal / zgomot pe de Vest Blot
- black or every dark film; film was exposed too long -- Fiecare întuneric negru sau film; filmul a fost expus prea lung
- blocking was insufficient ; non-specific binding of primary antibody and secondary antibodies were not washed completely -- Blocarea a fost insuficiente; non-specifice obligatorii de anticorpi primare și secundare de anticorpi nu au fost spălate complet
- washing was insufficient -- A fost insuficient de spalat
- film glows in dark! -- Filmul glows în întuneric! - too high secondary or primary dilutions -- Prea mare dilutions primare sau secundare
Solutions to Dark Film: Solutii de Film de la Dark:
- expose for less time, decrease exposure time -- Expune pentru mai puțin timp, scăderea timpului de expunere
- increase blocking duration of non-fat dry milk 5% incubation or increase the concentration. -- Creșterea duratei de blocare a uscat fără grăsimi de lapte de 5% de incubație sau o creștere a concentrației.
- also you can try blocking with whole serum of the host animal with (or before) the secondary antibody -- De asemenea, aveți posibilitatea să încercați cu blocarea întregului ser de gazdă cu animale (sau înainte) anticorp secundar
- increase washing times and volumes to help remove any non-specific signal due to weak antibody binding. -- Creșterea volumelor de spalat ori, pentru a ajuta și de a elimina orice non-specifice de semnal slab din cauza anticorpilor obligatorii.
- using a stronger detergent to wash - Instead of TBST (Tween-20), use stronger detergents such as NP-40 or SDS which may provide a more stringent wash and reduce background (do this only if you band is strong! - washing also removes some your band of interest!) -- Folosind un detergent mai puternică de a spăla - În loc de a TBST (Tween-20), folosiți detergenți puternici, cum ar fi NP-40 sau SDS, care pot oferi o mai stricte de spălare și de a reduce fundal (face acest lucru doar dacă banda este puternic! - Spălare de asemenea, elimină unele dvs. trupa de interes!)
- very high secondary antibody (or even primary) concentration - perform optimization experiments to determine proper antibody dilutions. -- Foarte mari de anticorp secundar (sau chiar primar) concentrare - efectuează experimente de optimizare pentru a determina anticorpi buna dilutions. dilute the antibodies further. se diluează în continuare de anticorpi.
Troubleshooting Western Blots Problem: Rezolvarea problemelor de Vest Blots Problema:
Low Signal or Weak Signal Min semnal sau semnal slab
- due to not enough protein loaded on the gel -- Datorita nu suficient de proteine încărcate pe gel
- primary antibody is old or not good -- Primare anticorp este vechi sau nu este bună
- phospho-proteins usually need overnight primary antibody incubation -- Phospho-proteine de obicei nevoie de anticorpi peste noapte primare de incubație
- not enough secondary antibody -- Nu este suficient de anticorp secundar
- over-blocking -- Peste-blocarea
- developing reagents are bad / you made a mistake when preparing them -- Dezvoltarea de reactivi sunt rea / ați făcut o greșeală atunci când pregătirea acestora
Solutions to Low Signal or Weak Signal : Soluții pentru a Min Semnal slab sau Semnal:
- load more protein sample onto gel -- Incarca mai multe proteine spre exemplu de gel
- try fresh primary antibody -- Încercați proaspete de anticorpi primari
- incubate primary antibody overnite for phosphoproteins at 4 degrees C (cold room shaker) -- Se incubează anticorpi primari overnite pentru phosphoproteins la 4 grade C (la rece Shaker cameră)
- increase concentration of protein (lyse samples in less lysis buffer) -- Crește concentrația de proteină (lyse de eșantioane în mai puțin lysis buffer)
- decrease concentration of blocking agent -- Scăderea concentrației de agent de blocare
- check the developing reagents; prepare fresh ECL and re-ECL the membrane -- Să verifice în curs de dezvoltare reactivilor; pregăti proaspete ECL și re-ECL de membrana
- increase the concentration or the length of primary antibody incubation period -- Crește concentrația sau durata perioadei de incubație de anticorpi primari
- increase concentration or the length of secondary antibody incubation period -- Crește concentrația sau durata perioadei de incubație anticorp secundar
Fuzzy Bands, Bands Smeared, Bands not Sharp Fuzzy Formatii, Formatii Smeared, Formatii nu Sharp
- bands smeared due to hot gel -- Benzi de smeared cauza fierbinte gel
- bands fuzzy due to high voltage -- Benzi de fuzzy, datorită înaltă tensiune
Solutions to Fuzzy bands and Un-sharp Bands: Soluții pentru a fuzzy trupe și ONU clare Formatii:
- decrease voltage or current, run in cold room, and prepare new running buffer. -- Scadere de tensiune sau curent, executați în camera rece, precum și pregătirea de noi să fie difuzate tampon. ( heat causes the gel to lose its rigidity and its resolving power) (Căldură cauze de gel pentru a își pierde rigiditatea și putere de rezolvare)
- pre-soak transfer membrane in the appropriate transfer solution (determined by the membrane manufacturer) for the required length of time. -- Pre-soak de transfer membranar corespunzătoare, în soluție de transfer (stabilită de către producător membrana) pentru durata de timp necesară.
Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | ©2005-2007 Molecular Station.com, All rights reserved. Disclaimer / Termeni si conditii | Politica de confidențialitate | © 2005-2007 Molecular Station.com, Toate drepturile rezervate.
Send this page to a friend Trimiteți această pagină unui prieten
![[أربيك]](http://www.molecularstation.com/translate/images/flag_ar.gif){kind=small}
