Bioinformatics, Protocols, DNA RNA Protein Proteomics Bioinformatics, protocoalelor, ADN ARN proteine proteomics

Biology Home Protocols Bioinformatic Tools Biology Forums Molecular Biology Encyclopaedia Molecular Biology Images Bookmark Us! Biologie Acasă protocoalele Bioinformatic Instrumente Forumuri de Biologie Biologie Moleculară Enciclopedia Biologie Moleculară Imagini Bookmark Us!

home > protein > protein-protocols > western-blotting > index.php home> proteină> protocoale de proteine-> western blotting-> index.php

Molecular Biology Home Science News Science Videos DNA RNA Protein Proteomics Research BETA! Bioinformatics Lab Equipment Molecular Biology Techniques Molecular Biology Products and Services Related Biology Links Biologie Moleculară Home știință Știri știință Vizual ADN ARN proteine proteomica Cercetare versiune beta! Bioinformatics Lab Echipamente de Biologie Moleculară Tehnici de Biologie Moleculară Produse și servicii legate de Biologie Link-uri

Molecular Biology Blog Biologie Moleculară Blog

Send this page to a friend Trimiteți această pagină unui prieten

Intracellular Stations Statii de intracelulară

Antibody Botany Common Buffers Buffers Alphabetic Bookstore Cell Biology and Culture Gel Electrophoresis Histology Microarrays Immunology Mass Spectrometry Microbiology Molecular Imaging Peptide Proteomics Protein Microarray Chips PCR Real-Time PCR RNAi and SiRNA Stem Cell Biology Transfection Western Blot Antibody Botany comun Buffers Buffers alfabetic Librarie Biologie celulara si Cultura Gel Electrophoresis Histologie Microarrays Imunologie spectrometria de masă Microbiologie Molecular Imaging peptida proteomica Protein Microarray Chips PCR Real-Time PCR și RNAi siRNA Stem Cell Biology Transfection Western Blot

Western Blot Western Blot

Western Blot Protocols Western Blot Protocoale

Western Blot Forum Western Blot Forum

Western Blot Products Western Blot Produse

Western Blot Books Western Blot Carti

Western Blot Troubleshooting Western Blot Rezolvarea problemelor

Western Blot Books Western Blot Carti

Western Blotting Protocol Western Blotting protocol

Western-blot protocol Western-blot de protocol

Preparation of Samples for SDS-PAGE Gel Electrophoresis from Prepared Cell Lysates Pregătirea de eșantioane pentru SDS-PAGE Gel Electrophoresis de la preparati Cell Lysates

1. Prepare gels for SDS-PAGE Pregătirile pentru gels SDS-PAGE
2. Prepare 1X running buffer Pregătiți 1x execută tampon
3. Add 50 mL of beta-mercaptoethanol to 950 ml sample buffer (for 1 mL). Adăugați 50 ml de beta-mercaptoethanol la 950 ml de eșantion tampon (pentru 1 ml). (only if you have not pre-added beta-mercaptoethanol to sample buffer) (numai dacă nu ați adăugat pre-beta-mercaptoethanol eșantion de a-tampon)
4. Add sample buffer to each sample (pre-determine how much sample you can load per well - BioRad thin combs can retain about 30uL. Large combs can accomate up to 50uL). Adăugați mostră de tampon la fiecare eșantion (pre-determina cât de mult puteți încărca eșantion pe de bine - BioRad subțire, piepteni poate reține despre 30uL. Piepteni de dimensiuni mari pot accomate până la 50uL).
5. Vortex samples briefly. Vortex probe scurt.
6. Poke a hole in cap of each tube (to prevent the tops popping when boiling) Poke o gaura in cap de fiecare tub (pentru a preveni Topuri Traduceri atunci când fierbere)
7. Boil in heating block/water bath at (95°C) for 5 minutes (lower temperatures have been shown to prevent non-specific protein aggregation) Fiert în bloc de incalzire / baia de apă la (95 ° C), timp de 5 minute (mai scăzute temperaturi s-au dovedit a preveni non-proteine specifice de agregare)

After Boiling Protein Samples - Loading and Running the SDS-PAGE Gel După Boiling Protein variante - Încărcarea și rulează SDS-PAGE Gel

1. Centrifuge samples for 1 minute at high speed. Centrifugare probe pentru 1 minute la mare viteză.
2. Load sample into each lane. Eșantion de încărcare în fiecare banda.
3. Load MW (molecular weight ladder) reference. Incarca MW (greutate moleculară scării) de referință. (you may want (poate doriți
4. Run gel at 100V (100V through stacking gel, voltage can be increased up to 200V when running in separating gel with plenty of running buffer) Executare gel la 100V (100V prin stivuire gel, tensiunea poate fi mărită până la 200V, atunci când rulează în gel de separare cu o multime de rulează tampon)

Transfer of Protein Samples to Membrane Transfer de proteine Membrana de eșantioane, pentru a

1. Prepare 1X Transfer buffer Pregătiți 1x Transfer de tampon
2. Soak and shake gel in Transfer buffer for 15 min Soak și agitați în gel Transfer de tampon pentru 15 min
3. Soak nitrocellulose membrane (or PVDF) and filter paper (extra thick) for several minutes. Soak nitrocellulose membrana (sau PVDF) și un filtru de hârtie (extra grosime) pentru mai multe minute.
4. Place sandwich on transfer cell: Locul sandwich privind transferul de celule:

Extra thick filter paper CLEAR Extra-o grosime de un filtru de hârtie EVIDENTE
Membrane Membrana
Gel
Extra thick filter paper BLACK Extra-o grosime de un filtru de hârtie NEGRU

5. Electric transfer: 35V overnite or 90V for 1 hour depending on the size of your protein or your patience! Electrice de transfer: 90V sau 35V overnite de 1 oră în funcție de mărimea sau de proteine răbdare!

Western Blotting Protocol or Immunoblotting Western Blotting protocol sau Immunoblotting

1. Prepare 1X TBST from stock solutions. Pregătiți 1x TBST din stoc soluții.
2. Prepare blocking buffer (3% Bovine Serum Albumin or 5% Blotting-grade milk (Blotto) in TBST). Pregătiți-tampon de blocare (3% Bovine Serum albumina sau de 5% Blotting-clasa a laptelui (Blotto) în TBST). (you may want to try several different blocking times and conditions). (poate doriți să încercați de mai multe ori diferite de blocare și condițiile).
3. Wash membrane in 1X TBST with shaking for 10 min. Se spală în membrana 1x TBST cu miscat timp de 10 min.
4. Block at room temperature for 1 hour with blocking buffer (shaking or circular rotator) Bloc la temperatura camerei timp de 1 oră cu tampon de blocare (sau miscat circulare rotator)
5. Incubate your membrane (PVDF or nitrocellulose) with primary 1° Ab antibody overnight (for difficult blotting conditions ie phosphorylation of proteins) or 1 hour for ( easy conditions such as total protein) at 4°C (overnite) or room temperature (1 hour incubation only) covered with saran wrap (gentle shaking). Se incubează dvs. membrana (PVDF sau nitrocellulose) primare cu 1 ° Ab anticorpi peste noapte (pentru conditii dificile blotting adică phosphorylation de proteine) sau 1 ora pentru (cum ar fi condițiile de ușor total de proteine) la 4 ° C (overnite) sau temperatura camerei (1 ora doar de incubație), acoperita cu saran wrap (blând miscat). You can use plastic tubs from the dollar store for this (use these only for blotting!) or use pipette box bottoms. Puteți folosi de plastic tubs de la dolar la magazin pentru aceasta (doar pentru utilizarea acestor blotting!) Sau de a folosi caseta de pipetă de fund. The dilution for primary antibody is around 1:1000. De diluare pentru anticorp primar este în jur de 1:1000. See manufacturer's instructions. Vedeți instrucțiunile producătorului.
6. Wash with 1X TBST  3 X 15 min Se spală cu 1x TBST 3 x 15 min
7. Incubate your membrane (PVDF or nitrocellulose) with secondary antibody, 2° Ab for 30 – 45 min or (1 hour - for difficult blotting conditions) at room temperature. Se incubează dvs. membrana (PVDF sau nitrocellulose) cu anticorp secundar, 2 ° Ab pentru 30 - 45 min sau (1 ora - pentru condiții dificile blotting) la temperatura camerei. The dilution for secondary antibodies is usually 1:10,000 or higher. Secundar de dilu ț ie pentru anticorpi este, de obicei, 1:10000 sau mai mare. (ie 1uL of secondary in 10mL of TBST per membrane) See manufacturer's instructions.  You may want to add your antibody to blocking solution to decrease non-specific binding especially if you got high background in your first experiment. (de ex 1uL secundare în -10 ml de TBST pe membrana) A se vedea instrucțiunile producătorului. Este posibil să doriți să vă adăugați anticorpi la blocarea soluție de a reduce non-specifice, obligatorii, mai ales dacă ai ridicat de fond în primul experiment.
8. Wash with TBST   4-5 X 10 min. Se spală cu TBST 4-5 X 10 min. This is the most important washing step. Acesta este cel mai important pas de spalat.
9. ECL (5min) ECL (5min)
10. Expose to film. Expuneti pentru a filma. Usually exposure time of western blots is about 10-30 seconds. De obicei, timp de expunere de vest blots este de aproximativ 10-30 de secunde. Longer (5-10 minutes) for phosphorylation. Mai lung (5-10 minute) pentru phosphorylation. If you have a really weak signal, either you need to load more protein or try to increase exposure time (up to 30 minutes - you can try leaving it in a casette longer). Dacă aveți un adevărat semnal slab, fie va trebui să încărcați mai multe proteine sau încercați să mărească timpul de expunere (pana la 30 de minute - puteți încerca să lăsându-l într-un casetofon mai).
11. Keep your membrane! Păstrați-vă membrana! You can keep your membrane in TBST 1X in the fridge for a while. Puteți să vă mențineți în membrana TBST 1x în frigider pentru o perioada de timp. You may need it for the following reasons: 1) checking loading (paper reviewers may ask for total protein or a loading standard such as actin). S-ar putea să nevoie de ea, pentru următoarele motive: 1) de verificare de incarcare (hârtie revizori pot solicita pentru cantitatea totală de proteină sau de o încărcare standard, cum ar fi actin). Also, you can probe initially for a phospho-protein and then strip and reprobe for total protein. De asemenea, puteți proba inițial pentru o phospho-proteină și apoi benzi si reprobe pentru cantitatea totală de proteină.

Also see our Western Blotting Membrane Stripping Protocol De asemenea, ne vedeți Western Blotting Membrana de protocol stripping