home > protein > bradford-protein-assay-protocol > index.php home> proteină> Bradford-proteine-test de protocol-> index.php
 |
|---|
You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Trebuie să te înregistrezi înainte de a putea posta pe forumuri sau de a utiliza caracteristicile avansate. Register Now! Înregistrează-te acum! Its Free and Fast! Libera si rapid!
Already registered? Ești deja înregistrat? Login now below. Login acum de mai jos.
Already registered and Forgot your password? Ești deja înregistrat și V-ați uitat parola? Click below to recover it. Faceți clic mai jos pentru a le recupera.
Recover Lost Password Recuperare Parola uitata
Join now - it's fast and free! Inscrie-te acum - Este rapid și gratuit!
Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molecular Station este cea mai mare rețea de cercetători, oameni de știință și știință iubitori de oriunde!
Research is what I'm doing when I don't know what I'm doing. Cercetarea este ceea ce am eu fac când nu stiu ce am eu fac. ~Wernher Von Braun ~ Wernher von Braun
1. Reagent: The assay reagent is made by dissolving 100 mg of Coomassie Blue G250 in 50 mL of 95% ethanol. Reactiv: test de reactiv se face prin dizolvarea de 100 mg de Coomassie Blue G250 în 50 ml etanol 95%. The solution is then mixed with 100 mL of 85% phosphoric acid and made up to 1 L with distilled water. Soluția este apoi amestecat cu 100 ml de 85% acid fosforic și a înregistrat până la 1 l cu apă distilată. The reagent should be filtered through Whatman no. De reactiv ar trebui să fie filtrate prin Whatman nr. 1 filter paper and then stored in an amber bottle at room temperature. 1 filtru de hârtie și apoi stocate într-o sticlă brună, la temperatura camerei. It is stable for several weeks. Este stabil pentru mai multe săptămâni. However, during this time dye may precipitate from solution and so the stored reagent should be filtered before use. Cu toate acestea, în timpul this timp dye mai precipitatul de la soluție și depozitate astfel încât reactiv ar trebui să fie filtrate înainte de utilizare.
2. Protein standard . Protein standard. Bovine γ-globulin at a concentration of 1 mg/mL (100 µg/mL for the microassay) in distilled water is used as a stock solution. Bovine-γ globulina, la o concentrație de 1 mg / ml (100 μ g / ml pentru microassay) în apă distilată este folosit ca o soluție de stoc. This should be stored frozen at –20oC. Acest lucru ar trebui să fie stocate congelate la-20oC. Since the moisture content of solid protein may vary during storage, the precise concentration of protein in the standard solution should be determined from its absorbance at 280 nm. Deoarece conținutul de umiditate al solide de proteine poate varia în timpul depozitării, precise de concentrație de proteine în soluție standard ar trebui să fie determinată de la absorbance la 280 nm. The absorbance of a 1 mg/mL solution of γ-globulin, in a 1-cm light path, is 1.35. De absorbance de un 1 mg / ml soluție de γ-globulina, într-o lumină cm 1-cale, este de 1,35. The corresponding values for two alternative protein standards, bovine serum albumin and ovalbumin, are 0.66 and 0.75, respectively. Valorile corespunzătoare pentru două standarde alternative de proteine, albumina din ser de bovină și ovalbumină, sunt 0,66 și 0,75, respectiv.
3. Plastic and glassware used in the assay should be absolutely clean and detergent free. Obiecte din sticlă de plastic și utilizate în test trebuie să fie curată și detergentul absolut gratuit. Quartz (silica) spectrophotometer cuvettes should not be used, as the dye binds to this material. Cuart (siliciu) Spectrofotometru cuvettes nu ar trebui să fie folosite, ca de vopsitorie se leagă la acest material. Traces of dye bound to glassware or plastic can be removed by rinsing with methanol or detergent solution. Urme de vopsitorie obligată să Obiecte din sticlă sau din material plastic pot fi eliminate prin clătire cu metanol sau soluție de detergent.
1. Pipet between 10 and 100 µg of protein in 100 µL total volume into a test tube. Pipet între 10 și 100 μ g de proteine din 100 μ l intr-un volum total de test tub. If the approximate sample concentration is unknown, assay a range of dilutions (1, 1:10, 1:100, 1:1000). Dacă aproximative eșantion de concentrare este necunoscut, o gamă de test dilutions (1, 1:10, 1:100, 1:1000). Prepare duplicates of each sample. Pregătiți dubluri din fiecare eșantion.
2. For the calibration curve, pipet duplicate volumes of 10, 20, 40, 60, 80, and 100 µL of 1 mg/mL γ-globulin standard solution into test tubes, and make each up to 100 µL with distilled water. Pentru curba de calibrare, pipet duplicat volume de 10, 20, 40, 60, 80, și 100 μ l de 1 mg / ml γ-globulina standard de soluție în tuburi de test, și de a face fiecare de până la 100 μ l cu apă distilată. Pipet 100 µL of distilled water into a further tube to provide the reagent blank. Pipet 100 μ l de apă distilată într-un tub de a oferi mai mult de reactiv gol.
3. Add 5 mL of protein reagent to each tube and mix well by inversion or gentle vortexmixing. Adăugați 5 ml de reactiv de proteine pentru fiecare tub și se amestecă bine de Inversion vortexmixing sau blând. Avoid foaming, which will lead to poor reproducibility. Evitați spumare, care va duce la săraci reproductibilitate.
4. Measure the A595 of the samples and standards against the reagent blank between 2 min and 1 h after mixing. A595 masura de a eșantioanelor și a standardelor împotriva reactiv gol între 2 min si 1 h după amestecare. The 100 µg standard should give an A595 value of about 0.4. De 100 μ g standard, ar trebui să acorde o A595 valoare de aproximativ 0,4. The standard curve is not linear, and the precise absorbance varies depending on the age of the assay reagent. Curba standard nu este liniară, și precisă absorbance variază în funcție de vârsta de test reactiv. Consequently, it is essential to construct a calibration curve for each set of assays. În consecință, este esențial de a construi o curba de calibrare pentru fiecare set de expertize.
Microassay Method This form of the assay is more sensitive to protein. Metoda Microassay Această formă de test este mult mai sensibile la proteine. Consequently, it is useful when the amount of the unknown protein is limited (see also Note 9). În consecință, este util atunci când cantitatea de proteine este necunoscut limitate (a se vedea de asemenea Nota 9). 1. Pipet duplicate samples containing between 1 and 10 µg in a total volume of 100 µL into 1.5-mL polyethylene microfuge tubes. Pipet duplicat mostre conținând între 1 și 10 μ g într-un volum total de 100 μ l în 1,5 ml microfuge tuburi de polietilenă. If the approximate sample concentration is unknown, assay a range of dilutions (1, 1:10, 1:100, 1:1000). Dacă aproximative eșantion de concentrare este necunoscut, o gamă de test dilutions (1, 1:10, 1:100, 1:1000).
2. For the calibration curve, pipet duplicate volumes of 10, 20, 40, 60, 80, and 100 µL of 100 µg/mL γ-globulin standard solution into microfuge tubes, and adjust the volume to 100 µL with water. Pentru curba de calibrare, pipet duplicat volume de 10, 20, 40, 60, 80, și 100 μ l de 100 μ g / ml γ-globulina standard de soluție în microfuge tuburi, și de a se adapta volumul la 100 μ l cu apa. Pipet 100 µL of distilled water into a tube for the reagent blank. Pipet 100 μ l de apă distilată într-un tub de reactiv gol.
3. Add 1 mL of protein reagent to each tube and mix gently, but thoroughly. Adaugati 1 ml de reactiv de proteine pentru fiecare tub și se amestecă ușor, dar bine.
4. Measure the absorbance of each sample between 2 and 60 min after addition of the protein reagent. Absorbance de masura a fiecărui eșantion între 2 și 60 min după adaosul de reactiv de proteine. The A595 value of a sample containing 10 µg γ-globulin is 0.45. A595 de valoare a unui eșantion care conțin 10 μ g-γ globulina este de 0,45.
see also: Bradford Protein Assay a se vedea de asemenea: Bradford Protein Assay
Modified from protocol by Nicholas J. Kruger. Modificat de la protocolul de Nicholas J. Kruger.
Protein Concentration Protein Concentrarea
Protein Concentration Protocol Protein Concentrarea protocol
Lowry Protein Assay Lowry Protein Assay
Lowry Method Protocol Metoda Lowry protocol
Bradford Method Metoda Bradford
Immunoprecipitation Immunoprecipitation
Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | ©2005-2007 Molecular Station.com, All rights reserved. Disclaimer / Termeni si conditii | Politica de confidențialitate | © 2005-2007 Molecular Station.com, Toate drepturile rezervate.
Send this page to a friend Trimiteți această pagină unui prieten
![[أربيك]](http://www.molecularstation.com/translate/images/flag_ar.gif){kind=small}
