home > pcr > history-of-pcr > index.php home> PCR> Istorie-de-PCR> index.php
 |
|---|
 |  |  |  |  | |
|---|---|---|---|---|---|
PCR Protocols Protocoale de PCR | PCR Bioinformatics and Databases Bioinformatics PCR și baze de date | Learn about PCR Aflați mai multe despre PCR | PCR Kits and Products Kituri PCR și Produse | PCR Forum PCR Forum | PCR Books PCR Carti |
Also visit PCR Station De asemenea, vizitați PCR Station
Copyright 2006 MolecularStation Copyright 2006 MolecularStation
Polymerase Chain Reaction - PCR Polimeraza Chain reaction - PCR
Table of Contents : Cuprins:
Introduction to PCR - Polymerase Chain Reaction Introducere în PCR - polimeraza Retea de Reactie
Polymerase Chain Reaction (PCR) Retea de Reactie polimeraza (PCR)
PCR, a Concept to be Discovered PCR, un concept de descoperit
General Principles of the PCR General Principles a PCR
Polymerases/Reaction Specificity and Efficiency Polimerazele / Reactie specificității și eficienței
Utility of PCR Utilitarul de PCR
PCR and Molecular Cloning PCR și Moleculară Cloning
Misincorporation: Errors of In Vitro Systems Misincorporation: Erori de sisteme in vitro
Reaction Specificity Reacție specificitatea
Major Advantages of PCR as a Cloning Method include its Rapidity, Sensitivity, and Robustness Avantaje majore ale PCR, ca Cloning Metoda includ rapiditate, sensibilitate, și robustețe
Limitations of PCR Limitări de PCR
Instruments for PCR Instrumente pentru PCR
Oligonucleotide Synthesis Oligonucleotide de sinteza
Will PCR ever be replaced? Va fi înlocuit PCR vreodată? – Helicase-dependent Amplification (HDA) -- Helicase dependent de amplificare (hda)
More than 30 years ago, the introduction of recombinant DNA technology as a tool for the biological sciences revolutionized the study of life. Molecular cloning allowed the study of individual genes of living organisms; however this technique was dependent on obtaining a relatively large quantity of pure DNA. This depended on the replication of the DNA of plasmids or other vectors during cell division of microorganisms (1). Researchers found it extremely laborious and difficult to obtain a specific DNA in quantity from the mass of genes present in a biological sample (2). Recombinant DNA technology made possible the first molecular analysis and prenatal diagnosis of several human diseases. Fetal DNA obtained by amniocentesis sampling could be analyzed by restriction enzyme digestion, electrophoresis, southern transfer and hybridization to a cloned gene or oligonucleotide probes (3). However, southern blotting permitted only rudimentary mapping of genes in unrelated individuals (4). Mai mult de 30 de ani în urmă, introducerea de tehnologie de recombinare a ADN-ului ca un instrument pentru Științe Biologice revolutionized de studiu de viata. Molecular cloning permis studierea a genelor individuale, de organisme vii; totuși, această tehnică a fost dependentă de a obtine o cantitate relativ mare de pur ADN-ului. Aceasta depinde de replicare a ADN-ului de plasmide sau a altor vectori în timpul divizării celulelor de microorganisme (1). Cercetatori găsit că este deosebit de dificile și laborioase, pentru a obține o anumită cantitate de ADN de la masa de gene prezente într-un eșantion biologice (2 ). Tehnologia ADN recombinant a facut posibila prima analiză moleculară și prenatale diagnosticul de mai multe boli umane. Fetal ADN obținut prin amniocentesis de prelevare de probe ar putea fi analizate de restricție de enzime digestive, electrophoresis, de sud și de transfer la un hybridization genei clonate sau oligonucleotide probe (3). Cu toate acestea, sudul blotting permisă numai rudimentare de mapare de gene în legătură persoane fizice (4).
PCR, an acronym for Polymerase Chain Reaction (5,6), allowed the production of large quantities of a specific DNA from a complex DNA template in a simple enzymatic reaction. PCR is a recently developed procedure for the in vitro amplification of DNA. PCR has transformed the way that almost all studies requiring the manipulation of DNA fragments may be performed as a results of its simplicity and usefulness (7). PCR, un acronim pentru polimeraza Retea de Reactie (5,6), a permis producerea de cantități mari de un anumit complex de ADN de la un șablon de ADN într-o simplă reacție enzimatică. PCR este o recent dezvoltate proceduri pentru amplificarea in vitro a ADN-ului. PCR a transformat modul în care aproape toți, care necesită studii de manipulare a ADN-ului fragmente pot fi efectuate, ca rezultatele sale simplitatea si utilitatea (7).
In the 1980s, Kary Mullis (Figure 1) and a team of researchers at Cetus Corporation at Cetus Corporation conceived of a way to start and stop a polymerase's action at specific points along a single strand of DNA. Mullis also realized that by harnessing this component of molecular reproduction technology, the target DNA could be exponentially amplified. This DNA amplification procedure was based on an in vitro rather than an in vivo process (5,6,8). Cell-free DNA amplification by PCR was able to simplify many of the standard procedures for cloning, analyzing, and modifying nucleic acids (1). Previous techniques for isolating a specific piece of DNA relied on gene cloning – a tedious and slow procedure. PCR, on the other hand Kerry Mullis stated “lets you pick the piece of DNA you’re interested in and have as much of it as you want” (2,8). În anii 1980, Kary Mullis (Figura 1) și o echipă de cercetători de la Cetus Corporation la Cetus Corporation a conceput un mod de a porni și opri polimeraza este o acțiune specifică la punctele de-a lungul unei singure directie a ADN-ului. Mullis realizat de asemenea, că prin această componentă harnessing moleculară de reproducere, tehnologie, țintă a ADN-ului ar putea fi amplificată exponențial. Această procedură de amplificare a ADN-ului sa bazat pe un in vitro, mai degrabă decât un proces in vivo (5,6,8). Cell-a ADN-ului liber de amplificare PCR a fost capabil de a simplifica multe dintre de proceduri standard de clonare, analiza, precum și modificarea nucleic acids (1). anterioare tehnici de izolare pentru o anumită bucată de ADN pe clonare de gene - o procedură lentă și tedious. PCR, pe de altă parte, Kerry a declarat Mullis "vă permite să alegeți bucată de ADN care vă interesează și să aibă cât mai multe din aceasta, după cum doriți "(2,8). When other Cetus scientists eventually succeeded in making the polymerase chain reaction perform as desired in a reliable fashion, they had an immensely powerful technique for providing essentially unlimited quantities of the precise genetic material molecular biologists and others required for their work (8). Since the first report in1985, more than 5000 scientific papers were published by 1992 (1). Furthermore, the large number of publications of course makes it impossible to review all the important contributions to the development and application of PCR technology; however we will attempt to review here the most important developments in the practice of basic PCR. Când Cetus altor oameni de știință, eventual, a reusit sa faca lant de polimeraza reacție de dorit ca într-o manieră fiabilă, care a avut un puternic immensely tehnica pentru furnizarea de esență cantități nelimitate de precise material genetic molecular biologi și altele necesare pentru munca lor (8). Deoarece Primul raport in1985, mai mult de 5000 de lucrari stiintifice au fost publicate până în 1992 (1). Mai mult, numărul mare de publicații, desigur, este imposibil de a revizui toate contribuții importante la dezvoltarea și aplicarea de tehnologii PCR; cu toate acestea, vom încerca să revizuiască aici cele mai importante evoluții în practica de bază PCR.
PCR was thought to be conceived by Dr. Kerry Mullis in 1983 while working at the Cetus Corporation in Emeryville, CA. However, some pioneering work was also done by Gobind Khorana in 1971 who described a basic principle of replicating a piece of DNA using two primers. Progress then was limited by primer synthesis and polymerase purification issues (9). In Mullis’s head, the invention grew from a theoretical scheme to perform limited dideoxynucleotide sequencing of unique human genes using synthetic oligonucleotides for the purpose of diagnosing common human disease mutations. An obvious obstacle to such a direct sequencing strategy was the high complexity of the human genome (3.3 X 109 base pairs). Thus, a second oligonucleotide or primer was added to block the progression of the synthesis of the first primer. Later however, this second primer was included to bind to the other DNA strand, so that each strand of the mutant allele would contribute to the eventual signal. If the scheme involving simultaneous hybridization of primers to each strand was modified by heating the mixture and then repeating the annealing and extension steps, then the primary signal would be increased even further. Repeating the steps would enable the products of the first round to be duplicated in the second cycle, to yield two copies. Repeating the cycle again would result in four copies, et cetera . Several weeks passed before this great idea was attempted (8). Two primers were synthesized to be perfectly complementary to each end of the 110 base pair region of a cloned segment of the human b-globin gene, the amplification was performed, and the products were identified by acrylamide gel electrophoresis. The end result was the anticipated 110 base pair DNA fragment and the beginning of PCR as a basic technique in molecular biology (5,6). PCR a fost gândit să fie realizat de catre dr. Kerry Mullis în 1983 în timp ce lucrează la Cetus Corporation în Emeryville, CA. Cu toate acestea, unele de pionierat de lucru a fost făcut de asemenea, Gobind Khorana în 1971 care este descris un principiu de bază de o bucată de replicarea ADN-ului, utilizând două primers. progresul apoi a fost limitat de sinteză și a primului polimeraza probleme de purificare (9). În Mullis cap, inventie a crescut de la un sistem pentru a efectua teoretic limitate dideoxynucleotide secvențiere unic de gene umane, utilizând sintetic oligonucleotides, în scopul de a diagnostica o boală la om; mutații. evidente Un obstacol în calea unei astfel de strategii de secvențiere directe a fost de mare complexitate din genomul uman (3,3 X 109 perechi de bază). Astfel, un al doilea oligonucleotide sau a primului a fost adăugat pentru a bloca progresia de sinteza a primului manual elementar. totuși mai târziu , Acest al doilea din prim a fost inclus pentru a obliga la alte directie a ADN-ului, astfel încât fiecare directie de mutant allele ar contribui la eventuala semnal. Dacă schema care implică simultană a hybridization primers la fiecare directie a fost modificat prin amestecul de încălzire și apoi repetarea recoacere și extinderea pași, apoi primare semnal ar fi crescut chiar mai departe. repetarea pași ar permite ca produsele de la prima rundă de a fi duplicat în cel de-al doilea ciclu, pentru a randamentului două exemplare. repetam din nou ciclu ar rezulta în patru exemplare, et cetera. trecut câteva săptămâni înainte de acest mare idee a fost încercat (8). primers Două au fost sintetizate pentru a fi perfect complementară fiecare sfârșitul celui de-al 110-pereche de bază clonate regiune a unui segment al omului b-globin gene, de amplificare a fost realizată, și produsele au fost identificate de acrilamidă gel electrophoresis. Rezultatul final a fost anticipat de bază pereche 110 fragment de ADN și de începutul PCR ca o tehnică de bază în biologie moleculară (5,6).
In Mullis's original PCR process(5,6,8), the enzyme was used in vitro (in a controlled environment outside an organism). În Mullis originale PCR proces (5,6,8), enzima a fost folosit in vitro (într-un mediu controlat în afara unui organism). The double-stranded DNA was separated into two single strands by heating it to 96°C. The double-stranded DNA a fost separate în două directii unic de incalzire-l la 96 ° C. At this temperature, however, the E.Coli DNA polymerase was destroyed so that the enzyme had to be replenished after the heating stage of each cycle. La această temperatură, cu toate acestea, E. coli polimeraza ADN-ul a fost distrus, astfel încât enzime în cauză a trebuit să fie completate de încălzire, după fiecare etapă a ciclului. Mullis's original PCR process was very inefficient since it required a great deal of time, vast amounts of DNA-Polymerase, and continual attention throughout the PCR process. Mullis originale PCR proces a fost extrem de ineficiente, deoarece este necesară o mare parte din timp, marea sume de ADN-polimeraza, atenția și continuă pe tot parcursul procesului de PCR.
Examination of the PCR amplification mechanism reveal its simplicity but also its elegance (Figure 2). Oligonucleotide primers are first designed to be complementary to the ends of the sequence to be amplified, and then mixed in molar excess with the DNA template and deoxyribonucleotides in an appropriate buffer. Following heating to denature the original strands and cooling to promote primer annealing, the oligonucleotides each bind to a different strand of the target fragment. The primers are positioned so that when each is extended by the action of a DNA polymerase, the newly synthesized strands will overlap the binding site of the opposite oligonucleotide. As the process of denaturation, annealing, and polymerase extension is continued the primers repeatedly bind to both the original DNA template and complementary sites in the newly synthesized strands and are extended to produce new copies of DNA (Figure 3). The end result is an exponential increase in the total number of DNA fragments that include the sequences between the PCR primers, which are finally represented at a theoretical abundance of 2n, where n is the number of cycles (1,7,13). Examinarea PCR mecanism de amplificare a dezvăluit sale de simplitate, dar si eleganta sale (figura 2). Oligonucleotide primers prima sunt proiectate pentru a fi complementare de capete ale secvenței care urmează să fie amplificat, apoi amestecat în exces molar cu ADN șablon și deoxyribonucleotides într-o tampon corespunzătoare. urma de încălzire pentru a denatura originalul directii de răcire și de promovare a primului recoacere, oligonucleotides se leagă de fiecare directie un alt fragment de țintă. primers sunt poziționate astfel încât, atunci când fiecare este prelungit de acțiune a unui ADN polimeraza, nou sintetizat directii va suprapune cu caracter obligatoriu din site-ul opus oligonucleotide. Ca procesul de denaturation, recoacere, și polimeraza extensie este continuat în mod repetat, primers leagă de ambele în original și complementară a ADN-ului șablon de site-uri din nou sintetizat directii si sunt extinse pentru a produce noile exemplare ADN-ului (Figura 3). Rezultatul final este o creștere exponențială în numărul total de fragmente de ADN, care include secvențe între PCR primers, care sunt reprezentate în final la o mare varietate de teoretice 2N, unde N este numărul de cicluri (1 , 7,13).
A DNA polymerase is a naturally occurring enzyme, a biological macromolecule that catalyzes the formation and repair of DNA. O ADN polimeraza este o enzimă de origine naturală, un macromolecule biologice care catalyzes formarea si repararea ADN-ului. It works by binding to a single DNA strand and creating a complementary strand. Este obligatoriu lucrarile de la o singură directie a ADN-ului și pentru a crea o directie complementare. The accurate replication of all living matter depends on this activity, where it functions to duplicate DNA when cells divide (10,11). Only recently have scientists learned to manipulate this activity and apply it to scientific research. The earliest PCR experiments utlilized the Klenow fragment of Escherichia coli DNA polymerase I at a temperature of 37C to amplify specific targets from human genomic DNA (5,6). Often these PCR reactions produced incompletely pure target product as judged by gel electrophoresis (1). These initial PCR amplifications with the Klenow fragment were not highly specific (5,6). Although a unique DNA fragment could be amplified ~200,000 fold from genomic DNA, only about 1% of the PCR product was the targeted sequence (13). A specific hybridization probe was required to analyse the amplified DNA (5,6). Exacte de replicare a tuturor materia vie depinde de această activitate, atunci când funcțiile de a ADN-ului atunci când celulele duplicat divide (10,11). Numai recent, oamenii de știință au învățat să manipuleze această activitate și să îl aplicăm de cercetare științifică. PCR de experimente, cât mai repede utlilized de Klenow fragment de Escherichia coli ADN polimeraza I, la o temperatura de 37C pentru a amplifica obiective specifice ADN-ului genomic de la uman (5,6). Deseori, aceste reacții PCR produse incomplet pur produs ca țintă evaluate de către gel electrophoresis (1). Aceste inițial PCR amplifications cu Klenow fragment nu au fost foarte specifice (5,6). Deși o unice ar putea fi fragment de ADN amplificat ~ 200000 ori de la ADN genomic, doar aproximativ 1% din produsul PCR a fost orientate după secvența (13). Un specifice hybridization proba a fost necesară pentru a analiza detaliată a ADN-ului (5,6).
Some PCR conditions were determined to increase the stringency of primer hybridization such as lower MgCl2 concentrations and higher annealing temperatures. Unele PCR au fost determinate condițiile de creștere a hybridization grund de rigoare, cum ar fi mai mici și mai mari concentrații MgCl2 recoacere pentru temperaturi.
Furthermore, the concentration of enzyme and primers, the annealing time, extension time, and number of PCR cycles all were found to effect the specificity of the PCR. Mai mult, concentrația de enzime și primers, recoacere timp, extensie de timp, și numărul de cicluri PCR toate s-au observat efecte specificitatea PCR.
Also, the concentration of a specific sequence in a sample can also influence the relative homogeneity of the PCR products (1,7,13,14,15). Deoxyribonucleotide triphosphates and magnesium in an appropriate buffer are also important ingredients for PCR. The efficiency and specificity of PCRs can be affected by variations in the concentration and ratio of free magnesium, deoxyribonucleotide triphosphates, and primers. De asemenea, concentrația de o anumită succesiune într-un eșantion de asemenea, poate influența relativă omogenitate a produselor PCR (1,7,13,14,15). Deoxyribonucleotide triphosphates de magneziu și într-un tampon corespunzătoare sunt, de asemenea, importante ingrediente pentru PCR. Eficienței și specificitatea PCRs poate fi afectat de variații în concentrația și raportul dintre libera de magneziu, deoxyribonucleotide triphosphates, și primers. These reagents must be optimized in order to achieve high specificity and yield (14). It was also discovered that the effect of temperature and oligonucleotide primer length on the specificity and efficiency of amplification by the polymerase chain reaction (15). Aceste reactivi trebuie să fie optimizat pentru a atinge un randament ridicat și de specificitatea (14). De asemenea, sa descoperit că efectul de temperatură și oligonucleotide grund pe lungime, specificitatea și eficiența amplificare de polimeraza lanțul de reacție (15).
The inactivation of the Klenow fragment of Escherichia coli DNA polymerase I at the high temperature required for strand separation required the addition of enzyme after the denaturation step of each cycle (5,6). Prior to 1988, anyone conducting a PCR reaction procedure was obliged to sit patiently by a series of water baths or heating blocks and add a fresh aliquot of E.Coli DNA polymerase after each denaturation step, which was typically carried out by immersing the reaction vessel in boiling water for ½ a minute to 3 minutes (7). This rather tedious step was eliminated by the introduction of a thermostable DNA polymerase, the Taq DNA polymerase (12) once, at the beginning of the PCR reaction. The thermostable properties of the DNA polymerase activity were isolated from Thermus aquaticus (Taq) (Figure 4) that grow in geysers of over 110C, and have contributed greatly to the yield, specificity, automation, and utility of the polymerase chain reaction (1,7,12). The Taq enzyme can withstand repeated heating to 94C and so each time the mixture is cooled to allow the oligonucleotide primers to bind the catalyst for the extension is already present (1,7). However, higher annealing temperatures were not established until the single “most important development of PCR development” (8), the purification and commercial distribution of a heat-resistant DNA polymerase from the thermophilic bacterium Thermus aquaticus ( Taq ) (12). De inactivare a Klenow fragment de Escherichia coli ADN polimeraza I la cel mai înalt nivel de temperatură necesare pentru directie de separare impuse de plus de enzimă denaturation după fiecare pas al ciclului (5,6). Inainte de 1988, orice persoană care efectuează o procedură de reacție PCR a fost obligat să stea cu răbdare de către o serie de bai de apa sau de incalzire blocuri și adăugați o nouă alicotă de E. coli ADN polimeraza denaturation după fiecare pas, de obicei, care a fost efectuată de către immersing de reacție în vas de apa de fierbere si jumatate pentru un minut la 3 minute (7 ). Acest pas a fost mai degrabă tedious eliminate prin introducerea unui thermostable polimeraza ADN, polimeraza Taq ADN-ului (12) o singură dată, la începutul celui de-al PCR reacție. Thermostable proprietăți ale ADN polimeraza activitate au fost izolate de la Thermus aquaticus (Taq) (Figura 4), care crește în geysers de peste 110C, si au contribuit foarte mult la randamentul, specificitatea, automatizari, utilități și a lanțului de reacție polimeraza (1,7,12). Enzima Taq poate withstand repetate de incalzire la 94C și așa de fiecare dată când amestecul este răcit pentru a permite oligonucleotide primers a angaja catalizator pentru extinderea este deja prezent (1,7). Cu toate acestea, recoacere pentru temperaturi mai mari nu au fost stabilite până la unice "cele mai importante de dezvoltare a PCR de dezvoltare" (8), de purificare și distribuție comercială a unei rezistente la căldură ADN-polimeraza de la thermophilic bacterie Thermus aquaticus (Taq) (12).
The isolation of a heat-resistant DNA polymerase also allowed primer annealing and extension to be carried out at elevated temperatures (1,7,12,13), thereby reducing mismatched annealing to nontarget sequences (non-specific amplification) or increasing specificity. In this way, for many amplifications the PCR product could be detected as a single ethidium bromide-stained band on an electrophoretic gel (12). This increased specificity also increased DNA yield of the target sequence. Moreover, longer PCR products could be amplified from genomic DNA, probably due to a reduction in the secondary structure of the template strands at the elevated temperature used for primer extension. The upper size limit for Klenow fragment polymerase amplification was only about 400bp. Taq polymerase and other thermostable polymerases have synthesized fragments up to 10 kb (1,7,12,13). The availability of Taq polymerase has also greatly simplified the automation of the reaction as it is a much easier task to construct an apparatus that will cycle a reaction tube through different temperatures than to manufacture a device that would perform both the thermocycling and the addition of enzyme aliquots. Currently there is a great variety of thermocyclers available commercially. This development has been a significant factor in the rapid application of this technology by the scientific community (7). De izolare termică a unei rezistente ADN-polimeraza a primului permis de asemenea, recoacere pentru extinderea și care urmează să fie efectuată la temperaturi crescute (1,7,12,13), reducând astfel nepotrivite recoacere pentru a nontarget secvente (non-specifice de amplificare) sau creșterea specificității. Astfel, pentru multe amplifications PCR produs ar putea fi detectat ca un singur ethidium bromide colora-o pe banda de electrophoretic gel (12). Acest lucru a crescut de asemenea, specificitatea randament crescut de ADN de secvență țintă. Mai mult, mai PCR produse ar putea fi amplificat de la genomic ADN-ul, probabil din cauza unei reduceri a structurii secundare de șablonul directii la temperatură ridicată utilizate pentru a primului extensie. Superior de limita de dimensiune pentru Klenow polimeraza fragment de amplificare a fost doar despre 400bp. Taq polimeraza și alte thermostable polimerazele au sintetizat fragmente de până la 10 kb (1,7,12,13). Disponibilitatea Taq polimeraza are de asemenea foarte mult simplificate de automatizare de reacție, deoarece este mult mai ușor o sarcină de a construi un aparat care vor un ciclu de reacție tub prin diferite temperaturi mult de un dispozitiv pentru fabricarea de care ar efectua atât thermocycling și de adăugarea de enzimă aliquots. În prezent, există o mare varietate de thermocyclers disponibile comercial. Această evoluție a fost un factor semnificativ în aplicarea rapidă a acestei tehnologii de către comunitatea științifică (7).
In addition to the production of double-stranded, blunt-ended DNA fragments which may be formed by PCR, two other features of the PCR scheme contribute greatly to the utility of PCR. First, the position of binding of the primers defines the boundaries of the amplified fragment and therefore the prior molecular cloning requirement of restriction endonuclease recognition sites is not required for PCR. As only a limited number of DNA sequences are restriction sites, PCR greatly increases the flexibility of choice of fragment size and composition. Secondly, it is not necessary for PCR oligonucleotides to be exactly complementary to the template DNA. “Tails” may be added to the 5’ end of the primer to introduce sequences within the priming sites which thus may be exploited to introduce restriction endonuclease recognition sites or other useful sequences such as mutations into the amplified DNA. This phenomena allowed the emergence of PCR as a method for rapid DNA cloning (1,7,13). În plus față de producția de double-stranded, Blunt-a ADN-ului s-au încheiat fragmente care poate fi constituită de către PCR, alte două trăsături ale regimului PCR contribuie în mod semnificativ la utilitarul de PCR. În primul rând, poziția de legare a primers definește granițele fragment de a amplificat și, prin urmare, înainte de clonare moleculară cerința de restricții endonuclease site-urile de recunoaștere nu este necesară pentru PCR. Ca doar un număr limitat de secvente de ADN sunt restricții de site-uri, PCR crește foarte mult de flexibilitatea de alegere a fragment de mărimea și compoziția. În al doilea rând, este nu este necesar pentru PCR oligonucleotides de a fi exact complementare la șablonul de ADN. "cozi" poate fi adăugat la 5 'sfârșitul celui de-al primului de a introduce secvențe în cadrul grunduire site-uri care pot fi exploatate, astfel, să introducă restricții endonuclease de recunoaștere sau de alte site-uri utile secvențe cum ar fi mutații în ADN-ului amplificat. Acest fenomen a permis apariția a PCR ca o metodă de clonare rapidă a ADN-ului (1,7,13).
Molecular cloning has benefited from the emergence of PCR as a technique. Direct cloning was first conducted using a 110 bp DNA fragment amplified by PCR and oligonucleotide primers which contained restriction endonuclease recognition sites added to their 5’ ends. These sites were used to facilitate cloning of the amplified DNA into an M13 plasmid (17). The 110 bp fragment was also sequenced to confirm that this approach was a rapid yet reliable approach to cloning. (Figure 5) Molecular cloning a beneficiat de apariția de PCR ca o tehnica. Direct clonare a fost pentru prima oară, folosind un efectuat 110 bp fragment de ADN amplificat prin PCR și oligonucleotide primers care conținea restricții endonuclease recunoașterea lor de site-uri adăugate la 5 'se termina. Aceste site-uri au fost utilizate pentru a facilita clonarea de amplificare a ADN-ului intr-un M13 plasmidă (17). 110 bp fragment sequenced a fost, de asemenea, pentru a confirma că acest mod de abordare a fost o abordare rapidă încă fiabile la clonare. (Figura 5)
Cell-based DNA cloning involves DNA replication in vivo, which is associated with a very high fidelity of copying because of proofreading mechanisms. However, when DNA is replicated in vitro as with PCR, the copying error rate is considerably greater. The most widely used polymerase, Taq DNA polymerase however, has no associated 3’to 5’ exonuclease to confer a proofreading function. Thus the error rate due to base misincorporation during DNA replication is rather high for Taq : for a 1 kb sequence that has undergone 20 effective cycles of duplication, approximately 40% of the new DNA strands synthesized by PCR using this enzyme will contain an incorrect nucleotide resulting from a copying error (16). Cell pe bază de clonare a ADN-ului implică DNA replication in vivo, care este asociat cu o foarte mare fidelitate de copiere, deoarece mecanismele de corectura. Cu toate acestea, atunci când a ADN-ului este reprodus in vitro, la fel ca și la PCR, rata de eroare de copiere este considerabil mai mare. Cele mai des folosite polimeraza, ADN polimeraza Taq cu toate acestea, nu are nici un asociat 3'to 5 'exonuclease pentru a conferi o corectura funcție. Astfel, rata de eroare din cauza bazei misincorporation în timpul de replicare a ADN-ului este destul de ridicat pentru Taq: 1 kB pentru o secvență care a suferit 20 de cicluri de eficiente de dublarea, de aproximativ 40% din noile directii a ADN-ului sintetizat prin PCR folosind această enzimă va contine o incorecte nucleotidici rezultă dintr-o eroare de copiere (16). Therefore, even if the PCR reaction involves amplification of a single DNA sequence, the final product will be a mixture of almost matching, but not identical DNA sequences. Despite the errors due to replication in vitro , DNA sequencing of the total PCR product may give the correct sequence due to the fact that the incorporation of incorrect bases is essentially random and the contribution of one incorrect base on one or more strands is overwhelmed by the contributions from the huge majority of strands which will have the correct sequence. However, if the PCR product is to be cloned in cells, several individual clones may need to be sequenced in order to determine the correct (consensus) sequence, prior to conducting further experiments. Prin urmare, chiar dacă PCR reacție implică amplificarea ADN-o singură secvență, produsul final va fi un amestec de aproape de potrivire, dar nu identice secvente de ADN. Ciuda din cauza erori de replicare, in vitro, secvențiere ADN-ul total al PCR, produsul poate da secvența corectă, datorită faptului că încorporarea incorecte baze este aleatoare, în esență, și de o contribuție incorecte pe baza de unul sau mai multe directii este copleșiți de contribuțiile de la uriasa majoritate de directii, care va avea secvența corectă. Cu toate acestea, în cazul în care PCR produs este de a fi clonate în celule, mai multe clone individuale poate fi necesar să fie sequenced, în scopul de a determina corect (consens) secvența, înainte de efectuarea de noi teste.
More recently, the problem of infidelity of DNA replication during the PCR reaction has been considerably reduced by using alternative heat-stable DNA polymerases which have associated 3’ to 5’ exonuclease activity. Pyrococcus furiosus ( Pfu ) DNA polymerases and Thermococcus Litoralis (VENT) are becoming more widely used because of the proofreading conferred by their associated 3’ to 5’ exonuclease activity (18). The resulting PCR product of Pfu for example, has a much lower level of mutations introduced by copying errors: for a 1 kb segment of DNA that has undergone 20 effective cycles of duplication, about 3.5% of the DNA strands in the product carry an altered base (16). Mai recent, problema de infidelity de replicare a ADN-ului în timpul de reacție PCR a fost considerabil reduse prin utilizarea alternativă de căldură-ADN polimerazele stabil, care s-au asociat 3 'la 5' exonuclease activitate. Pyrococcus furiosus (PFU) și ADN polimerazele Thermococcus Litoralis (Vent) devin din ce în ce mai mult utilizate pe scară largă, din cauza corectura asociate lor conferite de 3 'la 5' exonuclease activitate (18). rezultată din PCR produs PFU de exemplu, are un nivel mult mai mic de mutații introduse de erori de copiere: pentru un segment de 1 kB de ADN care a suferit 20 de cicluri de dublarea efectivă, aproximativ 3,5% din ADN in directii transporta un produs de bază modificat (16).
New approaches to improve specificity have been developed based on the recognition that the Taq DNA polymerase retains considerable enzymatic activity at temperatures well below the optimum for DNA synthesis. Thus, primers annealing non-specifically to a partially single stranded template region can be extended before the reaction reaches 72°C for extension of specifically annealed primers. If the DNA polymerase is activated only after the reaction has reached high (>70°C) temperatures, non-target amplification can be minimized (19,20). This “Hot start” approach can be accomplished by manual addition of an essential reagent to the selection tube at elevated temperatures. The addition of ssDNA binding protein has also been reported to increase specific amplification. A more user friendly approach is to use either inhibition or inactivation of the DNA polymerase itself. Noi abordări pentru a îmbunătăți specificitatea au fost dezvoltate pe baza recunoașterii că Taq polimeraza ADN-ul își păstrează considerabil activitatea enzimatică, la temperaturi cu mult mai optime pentru sinteza ADN-ului. Astfel, primers recoacere pentru non-specific la un singur parțial stranded șablon de regiune poate fi prelungită, înainte de reacție ajunge la 72 ° C pentru extinderea annealed specific primers. În cazul în care ADN polimeraza este activat doar dupa ce a atins reacție de mare (> 70 ° C) temperaturi, non-țintă amplificare pot fi minimizate (19,20). "Hot de start "Abordare poate fi realizată prin adăugarea manuală a unui reactiv esențiale de selecție a tubului, la temperaturi crescute. SsDNA obligatorii plus de proteine a fost de asemenea raportate la creșterea specifice de amplificare. Un utilizator mai ușor de abordare este de a utiliza fie inhibarea sau inactivarea a ADN-ului polimeraza virusului. Two types of inhibition of Taq DNA polymerase have been tried including oligonucleotide inhibition (21) and antibody (22) inhibition. Două tipuri de inhibare a Taq polimeraza ADN-ului s-au încercat, inclusiv oligonucleotide inhibarea (21) și anticorpi (22) inhibarea. Highly specific oligonucleotide inhibitors of both Taq DNA polymerases have been produced. Foarte oligonucleotide specifice de inhibitori de ambele Taq ADN polimerazele au fost produse. These selectively inhibit DNA polymerase activity at temperatures below 40°C and have been shown to function in Hot Start applications. Aceste selectiv inhiba ADN polimeraza activitate la temperaturi sub 40 ° C și s-au dovedit a funcționa în Hot Start aplicații. Alternatively, one can use an antibody against Taq DNA polymerase. Alternativ, se poate utiliza un anticorp împotriva Taq polimeraza ADN-ului. The antibody inhibits the DNA polymerase until the temperature of the PCR is such that the antibody is denatured at a temperature greater than 55°C, thereby releasing the enzyme. De anticorpi inhibă ADN polimeraza până la temperatura de PCR este că astfel de anticorpi este denaturat, la o temperatură mai mare de 55 ° C, prin urmare, eliberarea de enzime. However there are disadvantages to this type of Hot Start conditions. Cu toate acestea, există dezavantajele acestui tip de Hot Start condiții. In this case, one needs an antibody for each different enzyme used in a PCR and for a large number of PCRs this can rise costs significantly. În acest caz, este nevoie, un anticorp diferite pentru fiecare enzimă utilizată într-o PCR, precum și pentru un număr mare de PCRs acest lucru poate ridica semnificativ costurile. The most convenient form of Hot Start is to modify the DNA polymerase in such a way that it is inactive at room temperature (temperature-sensitive mutant), and is only re-activated following incubation at 95°C for 6-15 minutes (23). Cea mai convenabilă formă de Hot Start este de a modifica ADN polimeraza în așa fel încât acesta este inactiv la temperatura camerei (temperatură-mutant sensibile), și este doar re-activat următoarele incubație la 95 ° C timp de 6-15 minute (23 ).
Because of its simplicity, PCR is a popular technique with a wide range of applications Datorită simplității, PCR este o tehnica populara cu o gamă largă de aplicații
including direct sequencing, genomic cloning, DNA typing, detection of infectious microorganisms, site-directed mutagenesis, prenatal genetic disease research, and analysis of allelic sequence variations (1,7,13,16) which depend on essentially three major advantages of the method: inclusiv directe succesive, genomic clonare, tastând ADN, detectarea de microorganisme infectioase, regizat de site-mutagenesis, boli genetice prenatale cercetare, de analiză și de variațiile allelic succesiune (1,7,13,16), care depind în principal trei mari avantaje ale metodei :
Speed and ease of use: DNA cloning by PCR can be performed in a relatively short amount of time, within a few hours. Usually, a PCR reaction consists of around 30 cycles each cycle containing a denaturation, synthesis and reannealing step, with an individual cycle typically taking 3 Viteza și ușurința de utilizare: clonare de către PCR a ADN-ului pot fi efectuate într-o sumă relativ scurtă de timp, în câteva ore. In mod normal, o reacție PCR este format din aproximativ 30 de cicluri fiecare ciclu conține un denaturation, sinteza și reannealing pas, cu un individ ciclul de obicei, ținând 3 
5 min in an automated thermal cycler. This is clearly quicker than the time required for cell-based DNA cloning, which could take weeks of time. Furthermore, it is quite easy to setup a PCR reaction and the use of a thermocycler machine is also easy. Some time is required for the design and synthesis of oligonucleotide primers, but this has been simplified by the availability of computer software for primer design and rapid commercial or academic synthesis of custom oligonucleotides. Optimization of PCR conditions may be required such as primer annealing temperature, magnesium concentration, and primer concentration. However, the creation of gradient PCR machines which allow a variety of primer annealing temperatures to be tested at the same time has greatly decreased the time required for this step. 5 mn de un automat termice cycler. Aceasta este în mod clar mai rapidă decât cea de timp necesară pentru celula pe bază de clonare a ADN-ului, care ar putea dura săptămâni de timp. Mai mult, este destul de ușor să setați o reacție PCR, precum și utilizarea unui thermocycler masina este, de asemenea, ușor. anumită perioadă de timp este necesar pentru proiectarea și sinteza de oligonucleotide primers, dar acest lucru a fost simplificată de disponibilitatea software-ului pentru a primului computer proiectare rapidă și comerciale sau de servicii de sinteza academice oligonucleotides. optimizare a PCR condiții pot fi solicitate, cum ar fi primul recoacere temperatura, concentrația de magneziu, grund si concentrare. Cu toate acestea, crearea de masini de gradient PCR care permite o varietate de temperaturi grund recoacere pentru a fi testate, în același timp, a scăzut foarte mult timpul necesar pentru acest pas. Once the optimal conditions for a reaction have been obtained, the reaction can then be simply repeated (1,7,13,16). Odată ce condiții optime pentru o reacție au fost obținute, de reacție poate fi, apoi, pur și simplu repetate (1,7,13,16).
Sensitivity: PCR is capable of amplifying sequences from minute amounts of target DNA, even the DNA from a single cell (24). Such exquisite sensitivity has afforded new methods of studying molecular pathogenesis and has found numerous applications in forensic science, in diagnosis, in genetic linkage analysis using single-sperm typing and in molecular paleontology studies, where samples may contain minute numbers of cells. Sensibilitate: PCR este capabil amplifying secvente de minute de la valorile țintă a ADN-ului, chiar de ADN de la o singură celulă (24). Astfel de sensibilitate a exquisite oferite de noi metode de a studia molecular pathogenesis și și-a găsit numeroase aplicații în Forensic Science, în diagnostic, în analiză, folosind legătura genetică unică-sperma și tastând în moleculară paleontology studii, în cazul în care ar putea conține mostre de minute numărului de celule. However, the extreme sensitivity of the method means that great care has to be taken to avoid contamination of the sample under investigation by external DNA, such as from minute amounts of cells from the operator (1,7,13,16). Cu toate acestea, extrema sensibilitate a metodei mare grijă, înseamnă că trebuie să fie luate pentru a evita contaminarea a probei în cadrul anchetei de externe a ADN-ului, cum ar fi sumele de minute de la celulele de la operator (1,7,13,16).
Robustness: A broad range of nucleic acid sources are suitable templates for PCR amplification. Purified DNAs from various species and sources have been amplified. PCR can permit amplification of specific sequences from material in which the DNA is badly degraded or embedded in a medium from which conventional DNA isolation is problematic. Robustness: O gamă largă de surse de acid nucleic sunt adecvate pentru șabloanele de amplificare PCR. Purificată DNAs de la specii diferite de surse și să fi fost amplificat. PCR poate permite amplificarea secventelor specifice dintr-un material în care a ADN-ului este grav degradate sau încorporate într-un mediu de la care convenționale de izolare a ADN-ului este problematică. As a result, it is again very suitable for molecular anthropology and paleontology studies, for example the analysis of DNA recovered from archaeological remains. Ca rezultat, este din nou foarte potrivite pentru paleontology moleculară și studii de antropologie, de exemplu de analiza a ADN-ului arheologice recuperate de la rămâne. It has also been used successfully to amplify DNA from formalin-fixed or paraffin-embedded tissue samples, which has important applications in molecular pathology and, in some cases, genetic linkage studies. Aceasta a fost, de asemenea, utilizate cu succes pentru a amplifica de la ADN-formalin fix sau parafina-embedded mostre de țesut, care are importante aplicații în patologie moleculară și, în unele cazuri, studii de legătura genetică. Generally, the success of PCR amplification is greatest when target fragments are relatively abundant (1,7,13,16). În general, succesul de amplificare PCR, atunci când este cea mai mare țintă fragmente sunt relativ abundente (1,7,13,16).
Despite its huge popularity, PCR has certain limitations as a method for selectively cloning specific DNA sequences. Desi este uriasa popularitate, PCR are anumite limitări ca o metodă de clonare selectiv anumite secvente de ADN.
In order to construct specific oligonucleotide primers that permit selective amplification of a particular DNA sequence, some prior sequence information is usually necessary. În scopul de a construi specifice oligonucleotide primers, care permite amplificarea selectivă a ADN-o anumită secvență, secvență de informații înainte de unele este, de obicei, este necesar. This normally means that the DNA region of interest has been partly characterized previously, often following prior cell-based DNA cloning. Aceasta înseamnă că în mod normal în regiunea de interes a ADN-ului a fost caracterizat anterior în parte, de multe ori înainte de celule următorul text pe bază de clonare a ADN-ului. However, a variety of approaches have been developed that reduce or even exclude the need for prior DNA sequence information concerning the target DNA. Previously uncharacterized DNA sequences can sometimes be cloned using PCR with degenerate oligonucleotides if they are members of a gene or repetitive DNA family at least one of whose members has previously been characterized. Cu toate acestea, o varietate de abordări au fost dezvoltate, care reduce sau chiar să excludă nevoia de a ADN-ului înainte de informații referitoare la secvența ADN-ul țintă. Anterior uncharacterized secvente de ADN poate fi uneori clonate folosind PCR cu degenerate oligonucleotides dacă sunt membri ai unei gene sau repetitive ale ADN-ului de familie cel puțin unul dintre membri a căror anterioară a fost caracterizat. In some cases, PCR can be used effectively without any prior sequence information concerning the target DNA to permit indiscriminateamplification of DNA sequences from a source of DNA that is present in extemely limited quantities. În unele cazuri, PCR poate fi folosit în mod eficient, fără nici o secvență de informații prealabile privind țintă a ADN-ului pentru a permite indiscriminateamplification secvente de ADN de la o sursă de ADN care este prezentă în cantități limitate extemely. Therefore, although PCR can be applied to ensure whole genome amplification, it does not have the advantage of cell-based DNA cloning in offering a way of separating the individual DNA clones comprising a genomic DNA library. Prin urmare, deși PCR pot fi aplicate pentru a asigura întreg genomul amplificare, ea nu are avantajul de a celulelor pe bază de ADN în clonare, oferind o modalitate de separare a ADN-ului clone individuale dintr-o bibliotecă a ADN-ului genomic.
The amount of PCR product obtained in a single reaction is also much more limited than the amount that can be obtained using cell-based cloning where scale-up of the volumes of cell cultures is possible. Valoarea PCR produs obținut într-o singură reacție este, de asemenea, mult mai limitată decât suma care pot fi obținute prin utilizarea de celule pe bază de clonare în cazul în care până la scară de-a volumului de culturi de celule este posibil. The efficiency of a PCR reaction will vary from template to template and according to various factors that are required to optimize the reaction but typically only comparatively small amounts of product are achieved. Eficiența o reacție PCR vor varia de la șablon la șablon și în funcție de diferiți factori, care sunt necesare pentru a optimiza reacție, dar de obicei doar comparativ mici cantități de produs sunt realizate.
Although the theoretical yield of PCR is exponential, the actual yield of a PCR is much less indicating that the scheme is operating with less than its maximum potential. For example, the amount of product at each cycle eventually levels off. This plateau may be explained by the following phenomena. First, some of the template may never be available due to strand breaks or failure of the DNA to dissociated from other macromolecules during purification and the initial thermocycles. Secondly, the amount of enzyme is finite and eventually activity may decrease. Thirdly, as the concentration of the double-stranded product reaches high levels, competition increases between annealing of template (PCR product) to primer and reannealing of the complementary template strands (1,7,13). Deși teoretic randament de PCR este exponențială, randamentul real al unui PCR este mult mai mic, care indică faptul că sistemul este de operare cu mai puțin de potențialul său maxim. De exemplu, cantitatea de produs, eventual, la fiecare ciclu de nivelurile de reducere. Acest platou poate fi explicată de următoarele fenomene. În primul rând, o parte din șablon nu mai fi disponibile din cauza directie pauze sau eșecul de a ADN-ului pentru a disociate de alte macromolecule în timpul purificare și inițiale thermocycles. În al doilea rând, suma de enzimă este finit și, eventual, activitate poate scădea. În al treilea rând, în calitate de concentrare a dublu-stranded produsul ajunge la un nivel ridicat, crește concurența între recoacere de șablon (PCR produs) pentru a primului și reannealing din șablon directii complementare (1,7,13).
An obvious and many times great disadvantage of PCR as a DNA cloning method has been the size range of the DNA sequences that can be cloned. Un evident și de multe ori mare dezavantaj al PCR a ADN-ului ca o metoda de clonare a fost mărimea serie de secvente de ADN care pot fi clonate. Unlike cell-based DNA cloning where the size of cloned DNA sequences can approach 2 Mb, reported DNA sequences cloned by PCR have typically been in the 0.1 Spre deosebire de celule pe bază de clonare a ADN-ului în cazul în care dimensiunea de secvente de ADN clonate poate aborda 2 Mb, secvente de ADN clonate raportate de către PCR au fost de obicei în 0,1 
5 kb size range, often at the lower end of this scale. O dimensiune cuprinsă între 5 kb, de multe ori mai mic la sfârșitul acestui scară. Small fragments of DNA can usually be amplified easily by PCR, however it becomes increasingly more difficult to obtain efficient amplification as the desired product length increases. Mici fragmente de ADN poate fi amplificată de obicei, ușor de către PCR, cu toate acestea, devine din ce în ce mai dificil de a obține amplificarea eficient ca produsul dorit de lungime crește. Barnes (25) recognized a target length limitation to PCR amplification of DNA. He used a combination of a high level of an exonuclease-free, N-terminal deletion mutant of Taq DNA polymerase, Klentaq1, with a very low level of a thermostable DNA polymerase exhibiting a 3'-exonuclease activity (Pfu, Vent, or Deep Vent) to conduct high fidelity long PCR. Barnes (25) a recunoscut o țintă lungime de limitare a PCR de amplificare a ADN-ului. El a folosit o combinație de un nivel ridicat de o exonuclease-free, N-terminale de text eliminat mutant de Taq ADN polimeraza, Klentaq1, cu un nivel foarte scăzut al unui thermostable a ADN-ului polimeraza care prezintă un 3'-exonuclease activitate (PFU, Vent, sau Deep Vent) să desfășoare o inalta fidelitate lung PCR. At least 35 kb of bacteriophage lambda can be amplified to high yields from 1 ng of lambda DNA template. Use of this method yielded increased base-pair fidelity, the ability to use PCR products as primers, and the maximum yield of target fragment. Other conditions have been identified for effective amplification of longer targets, including amplification of up to 22 kb of the beta-globin gene cluster from human genomic DNA and up to 42 kb from phaga lambda DNA (26). Cel puțin 35 de kb bacteriophage lambda poate fi amplificată pentru a randamentelor ridicate de la 1 lambda de a ADN-ului șablon. Utilizați această metodă de produs a crescut baza de perechi de fidelitate, capacitatea de a utiliza produsele ca PCR primers, iar randamentul maxim de țintă fragment. Altele condițiile au fost identificate pentru mai eficiente de amplificare de obiective, inclusiv amplificarea de până la 22 KB de beta-globin gene cluster în ADN-ului genomic de la om și până la 42 kb phaga lambda de la ADN (26). The conditions for these long PCRs included increased pH, addition of glycerol and dimethyl sulfoxide, decreased denaturation times, increased extension times, and the use of a secondary thermostable DNA polymerase that possesses a 3'-to 5'-exonuclease, or "proofreading," activity. Condițiile pentru aceste PCRs incluse lung a crescut pH-ului, adăugarea de glicerol și dimetil sulfoxide, s-au diminuat denaturation ori, ori de prelungire a crescut, precum și utilizarea unui secundare thermostable ADN polimeraza, care dispune de un 3'-a 5'-exonuclease, sau "corectura, "Activitate. The "long PCR" protocol maintained the specificity required for targets in genomic DNA by using lower levels of polymerase and temperature and salt conditions for specific primer annealing. The ability to amplify DNA sequences of 10-40 kb will bring the speed and simplicity of PCR to genomic mapping and sequencing and facilitate studies in molecular genetics (26). Generally, the conditions for long range PCR involve a combination of modifications to standard conditions with a two-polymerase system. "PCR lung" de protocol menținute specificitatea necesară pentru obiective în ADN-ului genomic prin utilizarea mai scăzute niveluri de temperatură și polimeraza sare și condiții specifice pentru a primului recoacere. Capacitatea de a amplifica secvente de ADN de 10-40 kb vor aduce viteză și simplitate a PCR pentru a genomic cartografiere și secvențiere și de a facilita, în studiile de genetica moleculara (26). În general, condițiile pentru mult timp gama PCR implică o combinație de modificări condiții standard cu un sistem de două-polimeraza. This provides optimal levels of DNA polymerase and 3’to 5’ exonuclease activity which serves as a proofreading mechanism (16). Aceasta prevede niveluri optime de ADN polimeraza și 3'to 5 'exonuclease activitate care servește ca un mecanism de corectura (16).
Thermocyclers which automatically regulate temperatures for PCR cycling were introduced in 1986 (Figure 6). In addition to the advances in PCR reagents, new instruments for automated thermal cycling and for analyzing PCR products have been developed. New thermal cyclers have increased rates of heating, cooling, and heat transfer to modified reaction vessels. The reaction vessels accommodated by the first generation thermal cyclers (or even water baths and heating blocks) were standard plastic microfuge tubes. PCR amplification in thin capillary tubes allowed rapid thermal cycling, and DNA synthesis to 20s. The speed of the temperature changes achieved in these systems has allowed the precise definition of temperature optima for each individual step in the PCR cycle. The new generation thermal cyclers also accommodate more samples, have more precise thermal profiles, and are programmable (13). Thermocyclers care reglementează, în mod automat pentru temperaturi PCR cu bicicleta au fost introduse în 1986 (Figura 6). În plus față de avansuri în PCR reactivi, noi instrumente pentru automate de bicicleta si termice pentru a analiza PCR produse au fost dezvoltate. Termice cyclers noi au crescut ratele de încălzire, de răcire, de transfer de căldură și de modificare a navelor de reacție. reacție de către navele cazati prima generație termice cyclers (sau chiar bai de apa si incalzire blocuri) au fost standard microfuge tuburi din material plastic. amplificare PCR în tuburi capilare subtiri permis rapide termice cu bicicleta, și de sinteză a ADN-ului Anii'20. Viteza de schimbările de temperatură atins în aceste sisteme a permis definiția precisă a temperaturii Optima pentru fiecare pas in ciclul de PCR. Noua generație termice cyclers potrivi cu mai multe mostre de asemenea, au mai precise termice profile, și sunt programabile (13 ).
One of the least appreciated contributions to the widespread application of PCR has been the development of reliable automated chemistry for oligonucleotide synthesis. Until recently, the construction of a single oligonucleotide was a substantial task that could only be performed by a skilled organic chemist. Now it is possible to purchase either an oligonucleotide synthesizer that can be operated by a technician or the oligonucleotides themselves from a commercial or academic source. Multiplex oligonucleotide synthesis machines have been constructed with the aim of reducing the overall cost of synthesis (27,28). Unul dintre cele mai puțin apreciate contribuțiile la scară largă aplicare a PCR a fost dezvoltarea de fiabile automate de chimie pentru oligonucleotide sinteză. Până de curând, construcția unui singur oligonucleotide a fost o mare sarcină care ar putea fi efectuate numai de către o calificare organice chimist. Acum este este posibil să fie o achiziție oligonucleotide sintetizator, care pot fi exploatate de un tehnician sau oligonucleotides ele însele, de la o sursă academică sau comercială. Multiplex oligonucleotide sinteza mașini au fost construite cu scopul de a reduce costul total de sinteza (27,28). As the oligonucleotides define the eventual PCR products, there is little doubt that in the absence of their ready supply, PCR would not have enjoyed the wide acceptance that it has gained today (13). Ca oligonucleotides defini eventuala PCR produse, nu este îndoială că, în absența lor, gata de aprovizionare, PCR nu s-ar fi bucurat de o largă acceptare pe care le-a castigat azi (13).
Researchers agreed early on that the design of PCR primers was difficult and unreliable. Computer programs were devised to take all of the design criteria into account. Cercetătorii au convenit că la începutul anului de design din PCR primers a fost greu și nesigur. Calculator de programe au fost concepute pentru a lua toate criteriile de proiectare în considerare. One of the first programs written for primer design was Olga which made use of the implementation of Digital Research GEM (Graphics Environment Manager) on the Atari ST (29). Unul dintre primele programe scrise pentru primul desen sau model care a fost Olga făcut uz de punerea în aplicare a Digital GEM Cercetare (Graphics Manager de Mediu), pe de Atari ST (29). Olga was specifically suited to the polymerase chain reaction (PCR) allowing simultaneous analysis of two primer sequences. Olga a fost special adaptate pentru a lanțului de reacție polimeraza (PCR) care permite analiza simultană a două secvențe grund. The advantage of Olga was that it provided in one program analyses for direct repeats, secondary structures and primer dimerization as well as several useful 'finishing' tools for workers engaged in PCR optimization and oligonucleotide syntheses. The Primer3 program at the Whitehead Institute is now thought to be the most reliable and versatile tool currently available (30). Avantajul Olga că acesta a fost prevăzut într-un program de analize pentru a se repeta, secundar și structuri de grund dimerization, precum și mai multe utile "de finisare" Instrumente pentru lucrătorii angajați în PCR de optimizare și oligonucleotide sinteze. Primer3 program de la Institutul Whitehead este acum crezut a fi cele mai fiabile și disponibile în prezent versatil instrument (30).
PCRs can now be performed enabling the amplification of DNA fragments up to several kilobases in length by more than one million times their initial abundance. The procedure is highly automatable and requires just a few hours from beginning the thermocyling to product analysis. This was not the case previously, and the practical requirements for performing a PCR have been greatly simplified since the first manuscripts of the method (13). Today, most of the initial hitches or inefficiencies of the PCR have been worked out (8). Furthermore, PCR has expanded to include more than 270,000 articles (31). PCRs pot fi efectuate de acum care să permită amplificarea ADN-ului de până la câteva fragmente kilobases în lungime de mai mult de un milion de ori abundența lor inițială. Procedura este foarte automatable și necesită doar câteva ore de la începutul thermocyling de analiză a produsului. Acesta nu a fost cazul anterior, precum și cerințele practice pentru îndeplinirea unei PCR au fost foarte mult simplificate începând din prima manuscrise de metoda (13). Astazi, de cele mai multe inițială hitches sau ineficiențelor din PCR au fost elaborate (8). În plus, PCR a extins pentru a include mai mult de 270000 de articole (31).
Polymerase chain reaction is the most widely used method for in vitro DNA amplification however it requires thermal denaturation or thermocycling to separate the two DNA strands. In vivo , DNA is replicated by DNA polymerases with various accessory proteins. DNA helicase, a DNA polymerase accessory proteins acts to separate duplex DNA inside cells. Vincent et al. (32) have devised a new in vitro isothermal DNA amplification method by mimicking the in vivo replication mechanism. Helicase-dependent amplification (HDA) utilizes a DNA helicase to generate single-stranded templates for primer hybridization. Subsequent primer extension is then catalyzed by a DNA polymerase. HDA does not require an expensive thermocycler and thus PCR may be performed practically anywhere. In addition, it offers several advantages over other isothermal DNA amplification methods by having a simple reaction scheme and being a true isothermal reaction that can be performed at one temperature for the entire process. HDA offers great promise in the development of simple portable DNA diagnostic devices to be used in the field and at the point-of-care (32).
It is said the simplest and most convenient way to define PCR is as a technique . However, such a categorization eliminates the history of PCR's development as many individuals over the years contributed to the ideas behind the theory of PCR and the fine-tuning of the technique. The next simplest answer is to name an individual as the inventor of the polymerase chain reaction. Karry Mullis was awarded the Nobel Prize for Chemistry in 1993 for his discovery of PCR. However, this discovery is contested amongst many scientists, all of which may have contributed to unlocking this puzzle.
It has also been said that PCR did not exist until it was made to work in an experimental system. With this in mind, merely the thought of a concept is not sufficient; a concept must have been successfully been put into practice (33).
Although there is doubt as to the ultimate creator of PCR, and doubt as to the possibility that PCR may somehow or sometime be replaced, there is little doubt the impact that PCR has created over a short time span on the study of molecular biology and life.
References
1. Arnheim, N; Erlich, H; Polymerase Chain Reaction Strategy. ANNUAL REVIEW OF BIOCHEMISTRY, VOL. 61. XIV+1359P. , 1992. p. 131-156.
2. Appenzeller T. Democratizing the DNA sequence., Science , 1990 Mar 2, 247(4946).
3. Saiki R, K.; Scharf S; Faloona F; Mullis K. B; Horn G. T; Erlich HA; Arnheim N., Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia, Science , 1985 Dec 20, 230(4732):1350-4.
4. Southern, EM (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98:503-518.
5. Mullis K. B; Faloona F. A; Scharf S; Saiki R. K; Horn G; Erlich HA, Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology , 1986
6. Mullis K. B; Faloona FA Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology , 1987, 155:335-50.
7. Gibbs, RA; DNA Amplification by the Polymerase Chain Reaction. Analytical Chemistry, 1990, 62:1202-1214.
8. Mullis, KB; The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction, Scientific American, April 1990.
9. Kleppe, KE; Khorana , HG; (1971) J. Mol. Biol. 56, 341-346.
10. Keir, H; DNA polymerases from mammalian cells. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1965;4:81-128.
11. Fansler, BS; Eukaryotic DNA polymerases: their association with the nucleus and relationship to DNA replication. Int Rev Cytol. 1974;Suppl 4:363-415.
12. Saiki R. K; Gelfand D. H; Stoffel S; Scharf S. J; Higuchi R; Horn G. T; Mullis K. B; Erlich HA. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science , 1988 Jan 29, 239(4839):487-91.
13. Erlich, H. A; Gelfand, D; Sninsky, JJ Recent Advances in the Polymerase Chain Reaction., Science , 1991, v.252, n.5013, 1643-1651.
14. Williams, JF; Optimization strategies for the polymerase chain reaction. Biotechniques. 1989 Jul-Aug;7(7):762-9.
15. Wu DY, Ugozzoli L, Pal BK, Qian J, Wallace RB. The effect of temperature and oligonucleotide primer length on the specificity and efficiency of amplification by the polymerase chain reaction. DNA Cell Biol. 1991 Apr;10(3):233-8.
16. Strachan, T; Read AP; Human Molecular Genetics 2 . 1999. John Wiley & Sons Inc. Chapter 6 Section 1.
17. Scharf S. J; Horn G. T; Erlich HA Direct cloning and sequence analysis of enzymatically amplified genomic sequences. Science , 1986 Sep 5, 233(4768):1076-8.
18. Cline J, Braman JC, Hogrefe HH; PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. Nucleic Acids Res. 1996 Sep 15;24(18):3546-51.
19. Falooea, F., Weiss, S., Ferre, F., Mullis, K. 1990 6th Int.Conf . AIDS . Abstr.
20. D’Aquila, RT, Bechtel, LJ, Videler, JA, Eron, JJ, Goeczyca, P., Kaplan, JC 1991. Nucleic Acids Res. 19:3749.
21. Dang C, Jayasena SD. Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR. J Mol Biol. 1996 Nov 29;264(2):268-78.
22. Kellogg DE, Rybalkin I, Chen S, Mukhamedova N, Vlasik T, Siebert PD, Chenchik A. TaqStart Antibody: "hot start" PCR facilitated by a neutralizing monoclonal antibody directed against Taq DNA polymerase. Biotechniques. 1994 Jun;16(6):1134-7.
23. Kermekchiev MB, Tzekov A, Barnes WM. Cold-sensitive mutants of Taq DNA polymerase provide a hot start for PCR. Nucleic Acids Res. 2003 Nov 1;31(21):6139-47.
24. H. Li, UB Gyllenstein, X. Cui, RK Saiki, H. Ehrlich, and N. Arnheim. (1988). Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells Nature 335: 414-417.
25. Barnes WM.; PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates. Proc Natl Acad Sci US A. 1994 Mar 15;91(6):2216-20.
26. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA. Proc Natl Acad Sci US A. 1994 Jun 7;91(12):5695-9.
27. Caruthers MH, Barone AD, Beaucage SL, Dodds DR, Fisher EF, McBride LJ, Matteucci M, Stabinsky Z, Tang JY. Chemical synthesis of deoxyoligonucleotides by the phosphoramidite method. Methods Enzymol. 1987;154:287-313.
28. Beattie KL, Logsdon NJ, Anderson RS, Espinosa-Lara JM, Maldonado-Rodriguez R, Frost JD 3rd. Gene synthesis technology: recent developments and future prospects. Biotechnol Appl Biochem. 1988 Dec;10(6):510-21.
29. Bridges CG. Olga--oligonucleotide primer design program for the Atari ST. Comput Appl Biosci. 1990 Apr;6(2):124-5.
30. Rozen S, Skaletsky H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 2000;132:365-86.
31. Location world wide web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed Search: “PCR”
32. Vincent M, Xu Y, Kong H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 2004 Aug;5(8):795-800. Epub 2004 Jul 09.
33. Paul Rabinow. Making PCR, A Story of Biotechnology , University of Chicago Press, 1996
Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | ©2005-2007 Molecular Station.com, All rights reserved.
![[أربيك]](http://www.molecularstation.com/translate/images/flag_ar.gif){kind=small}
