Welcome to Molecular Station! Bine ati venit la Molecular Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Trebuie să te înregistrezi înainte de a putea posta pe forumuri sau de a utiliza caracteristicile avansate. Register Now! Înregistrează-te acum! Its Free and Fast! Libera si rapid!

Already registered? Ești deja înregistrat? Login now below. Login acum de mai jos.

User Name: Nume utilizator:

Password: Parola:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Ești deja înregistrat și V-ați uitat parola? Click below to recover it. Faceți clic mai jos pentru a le recupera.

Recover Lost Password Recuperare Parola uitata

Join now - it's fast and free! Inscrie-te acum - Este rapid și gratuit!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molecular Station este cea mai mare rețea de cercetători, oameni de știință și știință iubitori de oriunde!

Recent Forum Posts Recent Forum Posts

Membrane Hybridization to Screen a Library Membrana de hybridization la o bibliotecă de ecran

Screening Libraries using Membrane Hybridization Biblioteci Membrana de screening folosind hybridization

Under the conditions of temperature and ion concentration found in cells, DNA is maintained in a duplex (two-stranded) structure by the hydrogen bonds that form betwen the A and T bases and G and C bases in each strand. În condițiile de temperatură și concentrație de ioni de găsit în celule, ADN-ului este menținut într-un duplex (doua-stranded) structura de hidrogen formă de obligațiuni ca între A și T baze și G și C baze in fiecare directie. DNA duplexes can be denatured into single strands by heating them, usually in a dilute salt solution (eg, 0.01 M NaCl), or by raising the pH above 11. Duplexuri ADN poate fi denaturat în a le directii de încălzire, de obicei, se diluează într-o soluție de sare (de exemplu, 0,01 M NaCl), sau prin creșterea pH-ului de mai sus 11. If the temperature is lowered and the ion concentration in the solution is raised, or if the pH is lowered to neutrality, the AT and GC base pairs reform between complementary single strands. În cazul în care temperatura este scăzută și concentrația de ioni în soluție este ridicată, sau în cazul în care pH-ului este redus la neutralitate, AT și GC baza de perechi de reformă între complementare singur directii.

This process goes by many names: renaturation, reassociation, hybridization, annealing. Acest proces se duce de multe nume: renaturation, reassociation, hybridization, recoacere. In a mixture of nucleic acids, only complementary single strands (or strands containing complementary regions) will reassociate; the extent of their reassociation is virtually unaffected by the presence of noncomplementary strands. Într-un amestec de acizi nucleic, doar singur directii complementare (sau directii complementare care conțin regiuni) vor reassociate; amploarea lor reassociation este practic neafectate de prezența noncomplementary directii. Such molecular hybridization can take place between two complementary strands of either DNA or RNA, or between an RNA strand and a DNA strand. Astfel de moleculară hybridization poate avea loc intre doua directii complementare, fie de ADN sau ARN, sau între o directie ARN si ADN o directie. To utilize molecular hybridization in the detection of specific DNA clones, single stranded DNA from recombinant DNA molecules is attached to a solid support, commonly a nitrocellulose filter or treated nylon membrane. Pentru a utiliza moleculară hybridization în ADN-ul de detectare a clonelor specifice, unice stranded DNA de la moleculele de ADN recombinant este atașat la un suport solid, de comun nitrocellulose un filtru de membrana de nailon sau tratate. When a solution containing single0stranded nucleic acids is dried on such a membrane, the single strands become irreversibly bound to the solid support in a manner that leaves most of the bases available for hybridization to a complementary strand. Când o soluție care conține single0stranded acizi nucleic este uscat pe o astfel de membrana, singur directii obligați să devină ireversibil de sprijin solid într-un mod care lasă de cele mai multe baze de disponibil pentru hybridization complementare la o directie. Although the chemistry if this irreversible binding is not well understood, the procedure is very useful. Deși chimie, dacă acest ireversibile obligatorii nu este bine înțeles, procedura este foarte util. The membrane is then incubated in a solution containing radioactively labeled single-stranded DNA (or RNA) that is complementary to some of the nucleic acid bound to the membrane. De membrană este apoi incubate într-o soluție unică conținând radioactively etichetat-stranded DNA (sau ARN), care este complementară unele din acid nucleic obligată la membrana.

Under hybridization conditions (near neutral pH, 40-65 C, 0.3-0.6 M NaCl), this labeled probe hybridizes to the complementary nucleic acid bound to the membrane. În condițiile hybridization (pH-ul aproape neutru, 40-65 C, 0.3-0.6 M NaCl), aceasta proba cu eticheta hybridizes complementare pentru a acidului nucleic legat de membrana. Any excess probe that does not hybridize is washed away, and the labeled hybrids are detected by autoradiography of the filter. Orice exces de proba, care nu este spălat hybridize departe, și etichetate hibrizi sunt detectate de către autoradiography de filtru. The recombinant lamda virions present in plaques of a lawn of E. coli are transferred to a nylon membrane by placing the membrane on the surface of the petri dish. De recombinare a lamda virions prezente în plaques de un gazon de E. coli sunt transferate la o membrana de nailon, prin plasarea de membrana de pe suprafața de Petri antena de satelit. Many of the viral particles in each plaque absorb to the surface of the membrane, but many virions remain in the plaques on the surface of the nutrient agar in the petri dish containing a large number of individual lamda clones is reproduced on the surface of the membrane. Multe dintre particule virale, în fiecare placii de a absorbi de suprafață a membranei, dar multe rămân în virions de plaques de pe suprafața de agar nutritiv în vasele Petri conținând un număr mare de clone individuale lamda este reprodus de pe suprafața de membrana .

The original petri dish is refrigerated to store the collection of lamda clones. Originalul Petri antena de satelit este de refrigerare pentru a stoca o colecție de lamda clone. The membrane is then incubated in an alkaline solution, which disrupts the virions, releasing and denaturing the encapsulated DNA. De membrană este apoi incubate într-o soluție alcalină, care disrupts de virions, lansand encapsulated și denaturare a ADN-ului. The membrane is then dried, fixing the recombinant lamda DNA to the membrane's surface. De membrană este apoi uscat, de stabilire a lamda de recombinare a ADN-ului la suprafața membranei. Next, the membrane is incubated with a radiolabeled probe under hybridization conditions. Apoi, membrana este de incubate cu o proba sub radiolabeled hybridization condiții. Unhybridized probe is washed away, and the filter is subjected to autoradiography. Unhybridized proba este spălat departe, și de filtru este supus la autoradiography.

The appearence of a spot on the autoradiogram indicates the presence of a recombinant lamda clone containing DNA complementary to the probe. Aparitia un loc pe autoradiogram indică prezența unei clone lamda de recombinare a ADN-ului conțin complementare de proba. The position of the spot on the autoradiogram corresponds to the position on the original petri dish where that particular clone formed a plaque. Poziția fața locului cu privire la autoradiogram corespunde poziției pe original Petri în cazul în care acest fel de mincare special constituit o clona placii. Since the original petri dish still contains many infectioua virions in each plaque, viral particles from the identified clone can be recovered for replacing by aligning the autoradiogram and the petri dish and removing viral particles from the clone corresponding to the spot. Deoarece original Petri antena de satelit conține încă multe infectioua virions în fiecare placii, de la particule virale identificate Clona pot fi recuperate pentru înlocuirea prin alinierea la autoradiogram Petri și antena de satelit de particule virale și eliminarea de la clona corespunzătoare la fața locului. A similar technique can be applied for screening a plasmid library in E.coli cells. O tehnică similară poate fi aplicată pentru screening-o plasmidă biblioteca E.coli în celule.