All about polyclonal Antibodies. Totul despre policloni anticorpi.
Polyclonal Antibody Related External Resources - Protocols: Policloni Antibody cu resurse externe - protocoale:
Also visit Antibody Station for more on Polyclonal Antibodies . De asemenea, vizitați Antibody Station pentru mai multe detalii despre policloni anticorpi. It is a new site which lists antibody suppliers, learn about antibodies, and protocols. Acesta este un nou site-ul care a listelor de furnizori de anticorpi, afla despre anticorpi, și protocoale.
Polyclonal antibody protocols : Policloni anticorp protocoale:
Polyclonal Antibody Policloni Antibody
Polyclonal antibodies are antibodies derived from many B-cells or B-cell lines, similar to the mixture of antibodies found in blood sera. Policloni anticorpi anticorpi sunt derivate din mai multe celule B-sau B-linii de celule, la fel de amestec de anticorpi găsit în sânge seruri.
Polyclonal antibodies are therefore a mixture of many different antibody specificities. Policloni anticorpi sunt, prin urmare, un amestec de mai multe anticorp specificul.
Polyclonal antibody preparations purchased are mixtures of antibodies of many different specificities to the same antigen. Policloni anticorp preparatele sunt procurate amestecuri de anticorpi, foarte multe specificul la același antigen.
Immunization of a rabbit, mouse, goat, chicken, or other animal produces polyclonal antibodies. Immunization a unui iepure, mouse-ul, de capră, carne de pui, sau alte animale policloni produce anticorpi. Animal sera can be used directly, however it is better to purify polyclonal antibodies for laboratory usage. Seruri pentru animale pot fi utilizate direct, cu toate acestea este mai bine să se curățească policloni anticorpi pentru laborator de utilizare.
Polyclonal Antibody Preparation Pregătirea policloni Antibody
Based on the protocol by Dr. David Bowtell Pe baza de protocol de Dr. David Bowtell
Immunization of Mice: Immunization de "Șoricei":
Injections to immunize mice for the generation of polyclonal antibodies should be made at intervals of at least two weeks apart. Preparate injectabile, pentru a immunize mouse-uri pentru generarea de anticorpi policloni ar trebui să fie efectuate la intervale de cel puțin două săptămâni în afară.
The following 2 adjuvants have been successful: Următoarele 2 adjuvanți au avut succes:
- Freund adjuvant and MPL+TDM adjuvant ( RIBI ImmunoChem Research, Inc. ). Adjuvant Freund și MPL + TDM adjuvant (RIBI ImmunoChem Research, Inc). MPL is less hazardous than the first adjuvant. MPL este mai puțin periculoase decât primul adjuvant.
- For the first immunization injection: inject 15 - 50 ug if Antigen in 200 ul adjuvant, injected subcutaneously. Pentru prima injecție imunizarea: injectați 15 - 50 ug dacă Antigen în 200 adjuvant ul, injectat subcutanat.
- The second injection should occur 2 weeks later; You must then boost with 15 - 50 ug of Antigen in adjuvant. Cea de-a doua injecție ar trebui să apară 2 săptămâni mai târziu; Apoi trebuie să sporească cu 15 - 50 ug de antigen în adjuvant. (If time permits, boost again a month later). (Dacă timpul permite, din nou, să stimuleze o lună mai târziu).
- Seven to 10 days later bleed the mouse and test serum using the assay which will be used for screening. Șapte zile mai târziu la 10 sangerezi mouse-ul de test si ser folosind test, care vor fi folosite pentru verificare. If titre is not high enough, boost again two weeks after previous boost. Dacă titre nu este destul de mare, să stimuleze din nou de două săptămâni de la precedenta fructifice.
TOP TOP
Serum Preparation: Ser Preparare:
- After collecting, blood should be allowed to clot for 60 min . După colectare, de sânge ar trebui să li se permită să cheagurilor de 60 min. at 37°C or ON at 4°C. la 37 ° C sau pe la 4 ° C.
- Separate the clot from the sides of the tube (ringing) using a pasteur pipette. Separați cheagurilor de la maluri ale tubului (de apel), folosind o pipetă pasteur. Place clot at 4°C ON Locul cheagurilor la 4 ° C pe
- Spin at 10000 xg for 10 min. Spin la 10000 xg pentru 10 min. at 4°C to separate the serum. la 4 ° C, pentru a separa de ser.
- Serum can be stored at -20°C after adding Glycerol to 50%. Ser pot fi depozitate la -20 ° C, după adăugarea Glicerol la 50%.
If monoclonal antibodies are desired, once you have a "good" polyclonal and a reliable screening method proceed to the next step. Dacă anticorpi monoclonali sunt dorite, o dată ce aveți un "bun" policloni fiabile și o metodă de screening procedați la următorul pas.
TOP TOP
Rabbits: Iepuri:
Rabbits are immunized essentially as described above. Iepuri immunized sunt în esență, așa cum este descris mai sus. Injections: Preparate injectabile:
- First in Freund's complete 100-200ug/1ml injection, two sites (over each shoulder). În primul rând, în Freund-ul complet al 100-200ug/1ml de injectie, doua site-uri (peste fiecare umerilor).
- Second 1 month later in Freund's INCOMPLETE as above. În al doilea rând 1 lună mai târziu, în Freund's INCOMPLETE ca mai sus.
- Bleed 2 weeks later. Sângerări 2 săptămâni mai târziu. Boost 2 weeks later again (2 + 2 week cycle). Boost cu 2 săptămâni mai târziu, din nou, (2 + 2 săptămâni ciclu).
TOP TOP
PRODUCTION OF POLYCLONAL ANTIBODIES IN RABBITS (NEUSEELAND WHITE) Producerea de anticorpi policloni la iepuri (NEUSEELAND alb)
Based on the protocol by Dr.Walter Steffen. Pe baza de protocol de către Dr.Walter Steffen.
The rabbits should be 3-4 kg in weight and about 3 months old. La iepuri, ar trebui să fie 3-4 kg în greutate, de aproximativ 3 luni. About a third of the rabbit have endogenous anti-keratin antibodies and immunoactivity for various other cellular components. Despre o treime din carne de iepure au endogene keratin anticorpi anti-immunoactivity și pentru diverse alte componente celulare. This emphasizes the importance of taking pre-immune serum from any given rabbit. Aceasta subliniază importanța de a lua de pre-ser imun la orice dat de iepure.
Buffers and Solutions: Buffers și Soluții:
- Saturated ammonium sulfate solution, 2 mM EDTA, pH 8.0 Saturati soluție de sulfat de amoniu, 2 mm EDTA, pH 8,0
- 50 mM ammonium acetate, pH 8.0 50 mm acetat de amoniu, pH 8,0
- 70% ethanol Ie de etanol 70%
- Freund's adjuvant (complete & incomplete) Freund's adjuvant (completă și incompletă)
- Phosphate buffered saline (PBS) (see below) Fosfat tamponat salin (PBS) (a se vedea mai jos)
- Vaseline
- Xylene Xilen
TOP TOP
- Bring the rabbit from its cage and place it securely in a restraining box leaving the ear accessible. Aduceți de la cusca de iepure și puneți-l în siguranță într-o casetă de a pleca la restrictionarea ureche accesibile. Keep the rabbit relatively calm. Păstrați iepurasul relativ calm. Volumes of blood up to 50 ml can easily be collected from the main artery running down the center of the dorsal surface of the ear. Volume de sânge până la 50 ml, pot fi ușor colectate de la principalele artere care rulează în jos de centrul dorsale suprafata de ureche.
- Shave left ear around left vein with a fresh razor blade. Shave stânga în jurul urechii stânga cu o ordine de idei proaspete razor blade.
- Swab ear with 70% ethanol or isopropanol. Swab ureche cu 70% etanol sau isopropanol.
- Swab ear with xylene around artery-vein loop to dilate. Swab ureche cu xilen în jurul artera-vena la bucla dilate.
- Hold the tip of the ear (firmly) and the collection tube in one hand and with the free hand insert a 19G hypodermic needle into the dilated artery. Țineți vârful de ureche (ferm), precum și de colectare a tubului în o parte, și cu mână liberă a insera un ac 19G hypodermic în Dilated artera. The blood should begin to flow immediately into the collection tube. De sânge ar trebui să înceapă imediat, pentru a fluxului de colectare in tub. For best results use a portion of artery mid-way along the ear. Pentru cele mai bune rezultate folosi o parte din mijlocul arterei mod de-a lungul ureche.
- Collect up to 50 ml blood. Culegerea de până la 50 ml de sânge. Apply pressure just anterior to point of entry of needle to stop bleeding. Aplicați presiune doar pentru a anterioară, la punctul de intrare de ac pentru a opri sângerarea.
- Apply Vaseline to ear to soothe xylene irritation. Aplicați Vaseline la ureche să soothe xilen iritare.
- Put extra Vaseline on cut. Puneți în plus Vaseline pe tăiate.
Obtaining Serum: Obtinerea serului:
TOP TOP
- Swirl tube with collected blood to coat surface and to prevent clot attachment to tube. Swirl tub cu sânge colectate de la paltoane locuibilă și pentru a preveni cheagurilor de racordare a tubului.
- Incubate at 37 oC for 1 hour. Se incubează la 37 º C timp de 1 ora.
- Centrifuge at 2,500 g (setting #7 in a clinical table top) for 10 min. Centrifugare la 2500 g (setare # 7 clinice, într-un tabel de sus) pentru 10 min.
- Remove clot and spin serum at 3,000 g for 10 min. Eliminați cheagurilor de spin și ser de la 3.000 g pentru 10 min.
- Serum should be stored frozen. Ser ar trebui să fie stocate congelate.
Ammonium Sulfate Precipitation of IgG from Serum (4 oC, carried out in cold room): Precipitation Ammonium formă de sulfat de IgG de la Ser (4 º C, realizate în camera rece):
Ammonium sulfate precipitation is an easy method to obtain a fairly pure IgG fraction. Ammonium formă de sulfat de precipitare este o metodă ușoară de a obține o fracțiune IgG destul de pur.
TOP TOP
- Pool serum from one rabbit Biliard de la un ser de iepure
- Weight serum Greutate ser
W1 = _____ g W1 = _____ g - Wash tubes with min. Se spală cu tuburi de min. PBS and weigh again. PBS și cântărește din nou.
W2 = _____ g W2 g = _____ - Add 2/3 volume of W2 saturated ammonium sulfate, 2 mM EDTA, pH 8.0 Adăugați 2 / 3 din volumul W2 saturat formă de sulfat de amoniu, 2 mm EDTA, pH 8,0
Note: add very slowly, dropwise while stirring at 4 oC or use peristaltic pump. Notă: adauga foarte incet, amestecand dropwise în timp ce la 4 º C sau de a folosi peristaltic pump. - Stir for 15 min. Stir pentru 15 min.
- Transfer to 40 ml centrifuge tubes; wash beaker with 3 parts PBS : 2 part ammonium sulfate and add to tubes. Transfer de la 40 ml tuburi de centrifugare; Beaker spalare cu 3 părți PBS: 2 parte formă de sulfat de amoniu și de a adăuga tuburi.
- Spin at 12,000 g (Beckman JA-20: 10,000 rpm) for 10 min. Spin la 12000 g (Beckman JA-20: 10000 rot / min) timp de 10 min.
- Discard supernatant. Renunțați supernatant.
- Resuspend pellet in PBS [1/2 W1 = 1/2 vol.]. Resuspend granula în PBS [1 / 2 W1 = 1 / 2 vol.].
- Spin at 12,000 g for 10 min, discard pellet. Spin la 12.000 g timp de 10 min, se aruncă granulă.
- Collect supernatant in beaker, wash walls with PBS. Colectați supernatant în Beaker, spalare pereti cu PBS.
Determine W3 = _____ Determinați W3 = _____ - Add 2/3 vol. Adăugați 2 / 3 vol.. W3 saturated ammonium sulfate, while stirring. W3 saturat formă de sulfat de amoniu, în timp ce amestecand. Continue stirring for 15 min. Continuați amestecand timp de 15 min.
- Transfer suspension to 40 ml centrifuge tubes, wash tube with PBS/ammonium sulfate solution. Transfer de suspendare la 40 ml tuburi de centrifugare, se va spăla cu tub PBS / formă de sulfat de amoniu, soluție.
- Spin at 12,000 g for 10 min. Spin la 12.000 g pentru 10 min.
- Discard supernatant. Renunțați supernatant.
- Resuspend pellets in 1/4 W1 PBS. Resuspend pelete în 1 / 4 W1 PBS.
- Dialyse against PBS, 3-times 6 hours each. Dialyse împotriva PBS, de 3 ori în fiecare oră 6.
- Put serum in a graduated tube, rinse dialysis bag well with PBS. Puneți în ser a absolvit un tub, punga de bine salină izotonă de dializă cu PBS.
- Bring up to 1/2 W1 = 1/2 vol. Aduceți până la 1 / 2 W1 = 1 / 2 vol. in PBS. în PBS.
- Determine protein concentration and aliquot for storage. Determinați concentrația proteinei și pentru depozitarea alicotă. Measure the absorption at 280 nm. Masura de absorbție la 280 nm. The absorption of 1 mg/ml IgG solution is approximately 1.5. De absorbție de 1 mg / ml soluție de IgG este de aproximativ 1,5.
Immunization: Immunization:
TOP TOP
- Dissolve ~400-600 g antigen (~200-300 g per injection) in 2.2 ml 50 mM ammonium acetate, pH 8.0 or other appropriate buffer. Dissolve ~ 400-600 g de antigen (~ 200-300 g pe injecție) în 2,2 ml de acetat de amoniu 50 mm, pH 8,0 sau alte tampon corespunzătoare. Concentration depends on antigenicity of protein to be injected. Concentrarea depinde de antigenicity de proteine pentru a fi injectat.
- The amount of antigen needed to immunize an animal depends on it antigenicity and the method of immunization. Cantitatea de antigen necesare pentru a immunize un animal depinde de el antigenicity, precum și metoda de imunizarea. If proteins with low antigenicity are used, it will be helpful to denature the protein with a low concentration of SDS (up to 0.2%). Dacă, cu număr scăzut de proteine antigenicity sunt utilizate, va fi de ajutor pentru a denatura de proteine cu o concentrație scăzută de SDS (de până la 0,2%). Only highly purified antigen should be used for the production of polyclonal antibodies. Doar foarte purificat de antigen trebuie să fie utilizate pentru producerea de anticorpi policloni. An easy method to obtain a pure antigen is by SDS-PAGE. O metodă ușoară de a obține o pura de antigen este de SDS-PAGE. Proteins can be transferred to a sheet of nitrocellulose, stained with Ponceau S, cut out with a razor blade, and used as antigen (look for standard protocols in SDS-PAGE). Proteinele pot fi transferate de la o foaie de nitrocellulose, marcate cu Ponceau S, tăiate cu o razor blade, și folosit ca antigen (căutați în protocoale standard SDS-PAGE).
- Draw up 1.1.ml Freund's complete adjuvant with a 20G hypodermic needle, then draw up 1.1 ml of antigen solution. Realizarea completă 1.1.ml Freund's adjuvant cu un ac 20G hypodermic, apoi elaborează antigenului de 1,1 ml de soluție. Freeze remaining 1.1 ml for boost. Stai restul de 1,1 ml, pentru boost.
- Keeping the plunger immobile, remove the needle and attach a sterile 3-way stopcock. Tinerea la zi a plunger imobil, eliminați și atașați acul steril 3-cai stopcock.
- Mix the antigen with the adjuvant by attaching a second glass syringe to the stopcock and injecting back and forth. Se amestecă cu antigenul adjuvant prin atașarea unei a doua sticla de seringă pentru a stopcock și injectarea înapoi și mai departe. (Caution: some plastic syringes might react with the mineral oil.) (Atentie: unele seringi de plastic ar putea să reacționeze cu ulei mineral.)
- A complete emulsion will be formed after about 20-30 min; indicated by a rather sudden increase in viscosity of the solution. Un complet emulsie va fi format după aproximativ 20-30 min; indicate mai degrabă de o creștere bruscă în viscozitate a soluției.
Caution: be sure that the mounting is secure! Atenție: Asigurați-vă că este mount-area ca sigur! - After mixing wait about 20 min before injection to control that mixture is complete (If incomplete, oil will separate). După amestecare așteptați aproximativ 20 de minute înainte de injectare pentru a controla acest amestec este complet (Dacă incomplet, se va separa de ulei).
- Shave back of rabbit from shoulder blades to pelvis. Shave spatele umerilor lame de la iepure la casetă de litere.
- Clean back with 70% ethanol or isopropanol Curățenie inapoi cu 70% etanol sau isopropanol
- Inject under the skin into about 10-20 sides along the spine between shoulder blade and pelvis using a 21G hypodermic needle. Injectați sub piele în aproximativ 10-20 părți a lungul coloanei vertebrale între umerilor blade și casetă de litere, folosind un ac 21G hypodermic. (Note: First injection one week after last preimmune bleeding). (Notă: În primul rând injectare o săptămână după ultima preimmune sângerare).
- Wait one month and boost with a mixture of antigen and incomplete adjuvant. Stai o lună și la creșterea cu un amestec de antigen și incomplet adjuvant. Avoid scars from previous injection. Evitați scars anterioare de la injectare.
- Bleed after one week to check for immune-response. Sângerări după o săptămână pentru a verifica pentru răspuns imun. The boost should be repeated, if immune response was too weak; however, a different rabbit should be chosen, if rabbit did not react at all. De la creșterea ar trebui să fie repetate, dacă răspunsul imun a fost prea slab; cu toate acestea, un alt ar trebui să fie ales de iepure, carne de iepure, dacă nu a reactionat la toate. /LI> / Li>
References: Garvey, JS, Cremer, NE, & Sussdorf, DH (1977) In: Methods in Immunology. Referințe: Garvey, JS, Cremer, NE, & Sussdorf, DH (1977) In: Metode de Imunologie. Pub. The Benjamin/Cummings Publishing Company. The Benjamin / Cummings Publishing Company. Readings Mass. pp 545 Doilea Mass. pp. 545
TOP TOP Screening of Polyclonal Antibody using ELISA Assay Verificarea / filtrarea policloni Antibody folosind ELISA Assay
ELISA Protocol for Antibody Screen: ELISA pentru protocol Antibody Ecran:
Materials for ELISA: Materiale pentru ELISA:
° Plates - 96 well Dynatech Immulon, type 2. Placi ° - 96 bine Dynatech Immulon, de tip 2. (Fisher 17-0221-199). (Fisher 17-0221-199).
° PBS, TBS ° PBS, TBS
° PBS + 0.1% Tween 20 or TBS + 0.1% Tween 20. ° PBS + 0,1% Tween 20 sau TBS + 0,1% Tween 20.
° Blocking solution = 2% BSA (type V ) in PBS. Blocarea ° = soluție 2% BSA (tip V) în PBS. (Add 0.02% azide for longer storage.) (Adăugați 0,02% azide pentru mai depozitare.)
° Elisa buffer = 2% BSA + 0.1% Tween 20 in PBS ( azide optional ). ° Elisa tampon = 2% BSA + 0,1% Tween 20 în PBS (azide opțional).
° Enzyme linked antibody = Horseradish peroxidase 1 ° enzimatic legate de anticorpi = hrean peroxidazei 1
° Substrate = ABTS - 100X (from Zymed 00-2001)1 Substrat ° = ABTS - 100x (de la Zymed 00-2001) 1
° HRP buffer: 100mM Na Citrate pH 4.2( 490 mg citric acid + 720 mg Na citrate ° HRP tampon: 100mm citrat de Na pH-ului 4,2 (490 mg de acid citric + 720 mg de citrat de Na
dihydrate + 50 ml H2O, pH 4.2 ). dihidrat + 50 ml de H2O, pH 4.2).
° Hydrogen peroxide 30% ( 1000X ) ° peroxidul de hidrogen 30% (1000X)
TOP TOP
ELISA Protocol for Polyclonal Antibody ELISA pentru protocol policloni Antibody
1) ADSORBTION OF ANTIGEN 1) ADSORBTION de antigen
a) Dilute Ag to 10 ug/ml in PBS. a) Cu dilua la 10 ug / ml, la PBS.
b) Add 100 ul of Ag solution to each well. b) Adăugați Cu 100 ul de soluție pentru fiecare bine.
c) Leave ON covered with saran wrap, at 4°C. c) concediu în acoperite cu saran wrap, la 4 ° C.
2) BLOCKING 2) de blocare
a) Wash unbound Ag by inverting the plates and flicking the wells dry. a) Cu spală unbound de inverting de plăcuțele și flicking fantanile uscat.
b) Rinse by adding PBS to each well and inverting it again (use squirt bottle). b) Rinse prin adăugarea la fiecare PBS bine și inverting-l din nou (utilizarea squirt sticla).
c) Repeat the rinse twice. c) Repetați salină izotonă de două ori.
d) Add 100 ul of blocking solution to every well, leave 1 hr at room Temp or ON at 4°C. d) 100 Adăugare ul de blocare pentru fiecare soluție de bine, lăsați la 1 h Temp camera sau de pe la 4 ° C.
3) PRIMARY ANTIBODY 3) PRIMARE Antibody
a) Add the antibody to be tested : a) se adaugă de anticorpi pentru a fi testate:
Sup of cells = 25 ul , mix well by pipeting up and down (10 times). Sup = 25 de celule ul, se amesteca bine de pipeting în sus și în jos (10 ori).
serum, ascites = 1:100 and a serie of 1/5 dilutions. ser, ascites = 1:100 și o serie de 1 / 5 dilutions. Do dilutions in blocking solution. Nu dilutions blocarea în soluție.
b) Leave 1 hr at room temp or ON at 4°C. b) parasire 1 h la temp camera sau de pe la 4 ° C.
4) SECONDARY ANTIBODY 4) SECUNDARE Antibody
a) Wash unbound antibody 4 times with PBS + 0.1% Tween 20. a) spălătoare de unbound anticorpi de 4 ori cu PBS + 0,1% Tween 20.
b) Add 100 ul of enzyme linked antibody to all wells. b) Adăugați ul de 100 de enzime legate de anticorpi la toate fantanile. Do the appropriate dilutions in the Elisa buffer. Nu este cazul de dilutions în Elisa tampon. (ex: HRP is 2000X). (ex: HRP este 2000X).
c) Leave 1 hr at room temp or ON at 4°C. c) Lăsați 1 h la temp camera sau de pe la 4 ° C.
5) SUBSTRATE 5) substrat
a) Disolve substrate in water. a) Disolve substrat în apă.
b) Wash plate 4 times with PBS + 0.1% Tween 20 (use TBS instead of PBS for AP). b) Se spală placă de 4 ori cu PBS + 0,1% Tween 20 (în loc de a utiliza TBS PBS pentru AP).
c) Add 100 ul of substrate to every well. c) 100 Adăugare ul de substrat pentru fiecare bine.
d) Watch color development. d) Urmărește culoare de dezvoltare. This could take from a few seconds to 20 min. Acest lucru ar putea dura de la câteva secunde până la 20 min.
e) If needed, stop the reaction by adding 50 ul of 4M NaOH. e) dacă este necesar, opriți de reacție, adăugându-ul 50 de 4M NaOH.
f) Read absorption in Elisa reader at correct wavelength (for HRP system 416 nm, for AP - 405 nm). f) Citeste absorbție în Elisa cititor la lungime de undă corecte (pentru HRP sistem de 416 nm, pentru AP - 405 nm).
TOP TOP
Polyclonal Antibody Forum Topics Policloni Antibody Forum Subiecte
| Threads Subiecte |
| Thread Title / Poster Thread Titlu / poster | Last Post Ultimul Mesaj | Replies Răspunsuri | Views Vizite |
| 03-20-2008 05:43 AM 03-20-2008 05:43 AM | 1 | 289 |
You must REGISTER NOW to post a question in the Antibody Forum. Trebuie să ABONEAZA-TE ACUM pentru a posta o întrebare în Antibody Forum. Login now if you have already registered. Login acum, dacă te-ai inregistrat deja. Antibody Protocols Antibody Protocoale
Antibody Products & Services Antibody Produse & Servicii
Antibody Newsletter Antibody Newsletter
Other Antibody Websites Alte site-uri Antibody
See Antibody Station is a new site which covers antibodies, antibody suppliers, and other antibody-related information. Vezi Antibody Station este un nou site care se referă la anticorpi, anticorpi furnizori, precum și alte informații legate de anticorpi.
Find other antibody and Related Monoclonal Antibody topics here: Găsiți și alte anticorp cu anticorp monoclonal subiecte aici:
Send this page to a friend Trimiteți această pagină unui prieten 
![[أربيك]](http://www.molecularstation.com/translate/images/flag_ar.gif){kind=small}
