A análise ocidental do borrão pode detectar uma proteína específica em uma mistura de todo o número de proteínas ao dar-lhe a informação sobre o tamanho da proteína. Pode fazer isto baseado no uso de um anticorpo monoclonal específico ou do anticorpo polyclonal. Não importa se a proteína esteja sintetizada in vitro ou extraída das pilhas in vivo ou de vivo ex. Este método é, entretanto, dependente do uso de um anticorpo de alta qualidade dirigido de encontro a uma proteína desejada. Assim, você deve poder produzir pelo menos uma parcela pequena da proteína de um fragmento clonado do ADN ou purified a proteína que é injetada então em um rato ou em um coelho para gerar um anticorpo monoclonal ou um anticorpo polyclonal respectivamente. Você usará este anticorpo como uma ponta de prova para detectar a proteína do interesse.
A mancha ocidental diz-lhe quanto a proteína acumulou nas pilhas. Se você está interessado na taxa de síntese de uma proteína, a Rádio-imunoprecipitação (RASGO) pode ser o melhor ensaio para você. Também, se uma proteína é degradada rapidamente, a mancha ocidental não a detectará bem; você precisará de usar-se (RASGO). Veja a seção no RASGO para mais informação, e também uma carta comparativa útil que ilustre as diferenças entre estas duas técnicas.
Encha SOMENTE amortecedor running upto a parte inferior das chapa de vidro. (isto impede o escapamento atual do instrumento das rachaduras e dos defeitos)
Carregue o marcador da proteína (igualmente chamado a escada da proteína) (em pistas diferentes ao funcionar diversos geles para diferenciar geles diferentes de se)
Funcionando o gel de SDS-PAGE para o borrão ocidental
O gel do funcionamento em 100V a 110 V para o corredor rápido OU para a melhor definição funciona o gel em 35 - 40 miliampères (corrente constante) a fim começ faixas afiadas. Isto toma 2 - 2 horas de 1/2 ao funcionamento.
As bolhas devem ser consideradas se o instrumento está funcionando bem.
Verific dentro 5-10 minutos para ver se há a migração da escada da proteína para baixo.
Referências
`Laemmli do † do â, Reino Unido, segmentação de proteínas estruturais durante o conjunto da cabeça do bacteriófago T4. Natureza 227, 680-685, (1970)
`Laemmli do † do â, Reino Unido, segmentação de proteínas estruturais durante o conjunto da cabeça do bacteriófago T4. Natureza 227, 680-685, (1970)
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