Transfection da pilha

O Transfection descreve a introdução de material extrangeiro em pilhas eukaryotic usando um vetor do vírus ou outros meios de transferência.

O transfection do termo para métodos não-virais é o mais usado frequentemente na referência às pilhas mamíferas, quando a transformação do termo for preferida descrever transferência não-viral do ADN nas bactérias e em pilhas eukaryotic não animais tais como fungos, algas e plantas.

O Transfection das pilhas animais envolve tipicamente abrir pores ou “furos transientes” na membrana de plasma da pilha, para permitir a tomada do material. O material genético (tal como construções supercoiled do ADN ou do siRNA do plasmídeo), ou mesmo as proteínas tais como anticorpos, podem transfected. Além do que o electroporation, o transfection pode ser realizado misturando um lipido cationic com o material para produzir os lipossoma, que fundem com a membrana de plasma da pilha e depositam sua carga para dentro.

O significado original do transfection era “infecção pela transformação”, isto é introdução de ADN (ou de RNA) de um vírus ou de um bacteriófago do eukaryote em pilhas, tendo por resultado uma infecção. Porque a transformação do termo teve um outro sentido na biologia de pilha animal (uma mudança genética permitindo a propagação a longo prazo na cultura, ou na aquisição das propriedades típicas das células cancerosas), o transfection do termo adquiriu, para as pilhas animais, seu significado atual de uma mudança nas propriedades da pilha causadas pela introdução do ADN.

O Transfection é um método por que o ADN experimental pode ser põr em uma pilha mamífera cultivada. Tais experiências são executadas geralmente usando o ADN clonado que contem as seqüências de codificação e as regiões de controle (promotores, etc.) a fim testar se o ADN estará expressado. Desde que o ADN clonado pode extensivamente ter sido modificado (por exemplo, os locais obrigatórios da proteína no promotor podem ter sido alterados ou removido), o transfection é usado frequentemente testar se uma modificação particular afeta a função de um gene.

Diagrama do Transfection:

Aplicações do Transfection

A habilidade de sintetizar o RNA no laboratório é crítica a muitas técnicas. As pontas de prova Radiolabeled e não-radiolabeled do RNA são exigidas para muitos protocolos, e podem ser sintetizadas facilmente em reações da transcrição da pequena escala in vitro permitindo seu uso em hibridação do borrão e em ensaios da proteção da nuclease.

• Vetor ou ADN
• Pilhas
• Reagente do Transfection

In vitro a transcrição exige um molde linear purified do ADN que contem um promotor, triphosphates do ribonucleotide, um sistema do amortecedor que inclua DTT e magnésio

In vitro a transcrição exige um molde linear purified do ADN que contem um promotor, triphosphates do ribonucleotide, um sistema do amortecedor que inclua DTT e magnésio

Métodos do Transfection

Há uns vários métodos de introduzir o ADN extrangeiro em uma pilha eukaryotic. Muitos materiais foram usados como portadores para o transfection, que pode ser dividido em três tipos: polímeros, lipossoma e nanoparticles (cationic).

Um (e menos de confiança) dos métodos os mais baratos é transfection pelo fosfato de cálcio, descoberto original por F.L. Graham e A.J. camionete der Eb em 1973 [citação necessário] (veja igualmente [1]). a solução salina HEPES-protegida (HeBS) que contem íons do fosfato é combinada com uma solução do cloreto de cálcio que contem o ADN a transfected. Quando os dois são combinados, um precipitate fino positivamente - cálcio carregado e negativamente - do fosfato carregado dará forma, ligando o ADN a transfected em sua superfície. A suspensão do precipitate é adicionada então às pilhas a transfected (geralmente uma cultura de pilha crescida em um monolayer). Por um processo compreendido não inteiramente, as pilhas pegam algum do precipitate, e com ele, o ADN.

Outros métodos usam compostos orgânicos altamente ramificados, dendrimers assim chamados, para ligar o ADN e para começ o na pilha. Um método muito eficiente é a inclusão do ADN a transfected nos lipossoma, isto é os corpos pequenos, membrana-limitados que estão em algumas maneiras similares à estrutura de uma pilha e podem realmente fundir com a membrana de pilha, liberando o ADN na pilha. Para pilhas eukaryotic, o lipido-cation baseado transfection é usado mais tipicamente, porque as pilhas são mais sensíveis.

Um outro método é o uso de polímeros cationic tais como o DEAE-dextrano ou o polyethylenimine. Negativamente - o ADN carregado liga ao polycation e o complexo é pegado pela pilha através do endocytosis.

Uma aproximação direta ao transfection é o injetor do gene, onde o ADN é acoplado a um nanoparticle de um sólido inerte (geralmente ouro) que “seja disparado então” diretamente no núcleo de pilha do alvo. O ADN pode igualmente ser introduzido em pilhas usando vírus como um portador. Nesses casos, a técnica é chamada transduction viral, e, as pilhas seriam transduced.

Outros métodos do transfection incluem o nucleofection, o electroporation, o choque do calor, o magnetofection e reagentes proprietários do transfection tais como Lipofectamine, Dojindo Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene ou DreamFect.

Estábulo contra métodos transientes do Transfection

Para a maioria de aplicações do transfection, é suficiente se o gene transfected é expressado somente transiente. Desde que o ADN introduzido no processo do transfection não é introduzido geralmente no genoma nuclear, o ADN extrangeiro está perdido no estado avançado quando as pilhas se submetem à cariocinese. Se se deseja que o gene transfected permaneça realmente no genoma da pilha e de suas pilhas de filha, um transfection estável deve ocorrer.

Para realizar este, um outro gene é o co-transfected, que dá à pilha alguma vantagem da seleção, tal como a resistência para uma determinada toxina. Algumas (muito poucos) das pilhas transfected, terão introduzido por acaso o material genético extrangeiro em seu genoma. Se a toxina, para que o gene co-transfected oferece a resistência, é adicionada então à cultura de pilha, simplesmente aquelas poucas pilhas com os genes extrangeiros introduzidos em seu genoma poderão proliferate, quando outras pilhas morrerão. Após ter aplicado esta pressão da seleção por alguma hora, somente as pilhas com um transfection estável permanecem e podem ser cultivadas mais.

Um agente comum para o transfection estável é Geneticin, igualmente conhecido como G418, que é uma toxina que possa ser neutralizada pelo produto do gene resistente do neomycin.

In vitro a transcrição exige um molde linear purified do ADN que contem um promotor, triphosphates do ribonucleotide, um sistema do amortecedor que inclua DTT e magnésio

Pontas para o Transfection

• Use inibidores do RNAse sempre!
• Dinheiro da economia com o Polymerase do fago do RNA T7: Os clone com um Tag do N-terminal His-6 estão disponíveis. Se você obtem este clone, você pode purify grandes quantidades do polymerase T7 com atividade elevada (referência: Ele B, Rong M, Lyakhov D, Gartenstein H, Díaz G, Castagna R, PESO de McAllister, Durbin RK. Proteína Expr Purif. 1997, 9, 142-151).
• Para remover o molde do ADN, use um DNAse RNAse-livre. Nós usamos o DNase RQ1 (Promega) adicionado por 15 minutos e trabalha bem. 

Armazenando o reagente de Trasfection

• O RNA é armazenado melhor em um pH neutro com o EDTA.
• O amortecedor de TE é recomendado (Tris-HCl de 10 milímetros, pH 7.5, EDTA de 1 milímetro), porém este deve ser preparado com o RNAse purified livre (preferablly água do millipore).

Problemas do Transfection da pesquisa de defeitos

Transfections falhados

• Reagente velho do transfection
• Agente impropriamente armazenado do transfection
• ADN da menos qualidade ou vetor
• Uma insuficiente quantidade do ADN
• Insuficiente reagente do transfection
• Demasiado ADN
• Demasiado reagente do transfection

Referências no Transfection

Referências no Transfection

1. Bacchetti S, Graham F (1977). “Transferência do gene para a quinase do thymidine às pilhas humanas quinase-deficientes do thymidine pelo ADN viral purified da palavra simples de herpes”. Proc Acad nacional Sci EUA 74 (4): 1590-4. PMID 193108.