A técnica de imagem latente da microscopia de elétron revela umas imagens mais afiadas da cromatina
A técnica de imagem latente da microscopia de elétron revela umas imagens mais afiadas da cromatina
Os investigadores das Universidades de Illinois desenvolveram uma técnica para pilhas da imagem latente sob um microscópio de elétron que rendesse uma imagem mais afiada da estrutura da cromatina, firmemente do pacote da ferida de material genético e de proteínas que compo os cromossomas. Os resultados apareceram em métodos da natureza.
Os cientistas souberam para mais do que um século que proteínas, tais como histones, dae (dispositivo automático de entrada) no ADN da embalagem no núcleo de uma pilha. As pilhas humanas contêm 2 a 3 medidores do ADN, que devem ser torcidas e bobinado bastante ao ajuste em um 1/10 da largura da região de um cabelo humano.
Apesar do uso de técnicas de imagem latente poderosas, high-resolution tais como a microscopia de elétron, o mecanismo por que esta embalagem da cromatina ocorre permanece um mistério. As fibras densa coiled da cromatina são muito difíceis de visualizar, e pouco é sabido sobre como se condensam durante a divisão de pilha, ou desenrola para permitir a expressão de gene.
Em desenvolver seu método, a equipe de Illinois abordou uma dificuldade chave em pilhas da imagem latente usando a microscopia de elétron. Os estudos tradicionais “reparam” as pilhas com os produtos químicos poderosos (chamados fixador) para preservar sua estrutura para ver sob um microscópio. Mas os métodos padrão da fixação interferem com uma outra etapa no processo da imagem latente: o uso de anticorpos etiquetados etiquetar os componentes chaves das pilhas.
Estes anticorpos, que o alvo e a trava sobre às proteínas específicas na pilha, podem ser etiquetados com as etiquetas fluorescentes para a deteção na fotomicroscopia, ou com partículas do metal (ouro, neste caso) para a microscopia de elétron.
“Se você repara as pilhas primeiramente, você tem uma gota dramática na eficiência destas reações immunochemical,” disse Igor Kireev, um cientista de visita no departamento da pilha e da biologia desenvolvente e autor importante do papel. A foto do clique da imagem da microscopia de elétron para ampliar a cortesia de imagem de Andrew Belmont e de Igor Kireev a técnica nova expor pilhas vivas aos anticorpos etiquetados, uma aproximação que renda um sinal muito mais forte para a microscopia de elétron.
“E se seu alvo é interior a cromatina condensada, os anticorpos não têm nenhuma maneira de penetrar.”
Em vez de reparar as pilhas antes de manchar com anticorpos, os investigadores expor primeiramente pilhas animais vivas aos anticorpos etiquetados. Isto permitiu que os anticorpos penetrassem mais profundamente na estrutura da cromatina, e impulsionou o número de partículas do ouro que aderem às regiões de interesse. O sinal foi realçado adicionando uma solução de prata que precipitado (solidified) em cima do contato com o ouro.
“Nós estamos interessados na estrutura da cromatina, assim que nossos alvos são cromatina-limitam na maior parte proteínas,” Kireev disse.
Os investigadores tinham introduzido diversas cópias de um ADN bacteriano, chamadas o operador da laca, nos cromossomas. Uma proteína bacteriana, o repressor da laca, reconhece e liga ao operador da laca em pilhas vivas.
Os investigadores combinaram uma proteína do repressor da laca com uma outra proteína que apresentasse fluorescência o verde sob a luz azul. Esta proteína projetada aderiu aos cromossomas nas regiões que contêm as seqüências do operador da laca. Sob a luz azul, estas regiões apresentaram fluorescência. Um anticorpo ouro-etiquetado alvejado de encontro à proteína fluorescente verde (GFP) microinjected então no núcleo de uma pilha viva, que adicionasse um sinal metálico que poderia ser impulsionado com prata.
“Todo o isto combinado dá-nos um sinal muito melhor, um sinal muito mais forte, com a preservação estrutural muito melhor,” Kireev disse.
A proteína de brilho ajudou os investigadores a encontrar as regiões de interesse nas pilhas. Estas áreas eram então “immunogold” etiquetado e alvejado para a microscopia de elétron.
Nas micrografia resultantes os investigadores viram a mancha realçada dos cromossomas.
“Nós podemos agora aplicar este mesmo método de rotulagem da viver-pilha ao estudo na alta resolução muitas proteínas GFP-etiquetadas diferentes no citoplasma da pilha ou núcleo,” disse Andrew Belmont, um professor da pilha e do autor desenvolvente do biologia e o sênior do papel.
“Na tentativa compreender cromossomas, povos foi limitada pela maior parte ao visualização da baixa definição de proteínas cromossomáticas específicas usando a fotomicroscopia,” Belmost disse. “Isto significou que todos teve que fazer muita suposição de como as coisas são unidas, conduzindo em muitos casos a vago, modelos dos desenhos animados do que são prováveis ser estruturas cromossomáticas complicadas que realizam funções do ADN tais como a réplica e a transcrição.”
“Agora nós esperamos que nós podemos simplesmente olhar e para ver a estrutura real usando mais do que 10 vezes a definição mais elevada da microscopia de elétron,” Belmont disse. “Nós somos excitados realmente para ver o que nós encontraremos usando nosso método novo”
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