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Obtendo a alta qualidade, o RNA intato é primeiro e frequentemente a maioria de passo crítico em executar muitas experiências fundamentais da biologia molecular, incluindo a análise do norte, os ensaios da proteção da nuclease, o RT-PCR, o RNA que traçam, in vitro a tradução e a construção da biblioteca do cDNA. Para ser bem sucedido, entretanto, o procedimento da isolação do RNA deve incluir algumas etapas importantes ambas antes e depois da purificação real do RNA.
Dependendo do RNA a ser extraído, há as propriedades do RNA que permitem que seja isolado longe de outros materiais celulares tais como proteínas, ADN e mesmo lipidos.
O RNA de mensageiro ou o mRNA contêm resíduos de uma adenosina do estiramento sob a forma de um poli (A) cauda. Isto foi explorado para permitir que o mRNA seja limitado a poli (T) colunas ou grânulos de afinidade.
Se você tem atualmente um método preferido para isolar o RNA, continue a usá-lo.
Se você não isolou o RNA de seu sistema antes que e seu organismo não esteja na seguinte lista, nós podemos ajudá-lo a identificar os protocolos estabelecidos que foram usados isolando o RNA para a mancha do norte ou o RT-PCR de seu sistema. Estes tipos de protocolos igualmente renderão o RNA da “microarray-classe”.
Funcione sempre um gel do agarose de seu RNA para avaliar a qualidade.
NOTA: Se você usa não um reagente baseado coluna da purificação tal como TRIzol que nós o recomendamos precipitamos seu RNA uma segunda vez do álcool etílico ou você passa-o através de uma coluna de Rneasy ou de um dispositivo similar. Isto segura a remoção de todos os contaminadores orgânicos (veja espectros abaixo).
Fraccionamento nuclear/cytoplasmic eficiente pode rapidamente ser avaliado desnaturando a análise do gel do agarose (veja figura 1). As faixas que correspondem ao rRNA do precursor devem ser equivalentes na fração total e nuclear do RNA. As faixas do rRNA 18S e 28S serão menos intensas na fração nuclear do RNA do que no RNA do total ou no RNA cytoplasmic da fração. Em algumas linha celular, por exemplo 293 e pilhas COS-7, esta diferença será dramática, mas em outras linhas das pilhas tais como pilhas HeLa, as faixas do rRNA são somente ligeiramente menos intensas no RNA nuclear do que no RNA total ou cytoplasmic da fração. “
As leituras A260 e 260/280 das relações não são bastante para assegurar o RNA da pureza elevada. Você deve tomar um espectro UV cheio. Estão abaixo 3 espectros do exemplo que todos têm bom 260/280 das relações, mas têm purezas muito diferentes. Você pode igualmente usar a relação de 260/230 para ajudar a determinar a quantidade de contaminação orgânica em seu RNA. É um número muito mais variável do que a relação de 260/280, mas geralmente, as relações acima de 1 indicam a boa pureza.
As pilhas foram lavadas então em PBS e extraíram sucessivamente como descritas. Primeiramente, as pilhas foram extraídas com o amortecedor de Nonidet P-40 (10 milímetros de Tris-Cl, (pH 7.5), 10 milímetros de NaCl, 3 milímetros de MgCl2, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 milímetro DTT). A pelota restante (reticulum endoplasmic áspero (RER) e núcleo) foi lavada no mesmo amortecedor e extraída no amortecedor B (10 milímetros de Tris-Cl (pH 7.5), 10 milímetros de NaCl, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, o EDTA de 40 milímetros, 40 units/ml Rnasin, 1 milímetro DTT). A pelota nuclear restante foi lavada no mesmo amortecedor e extraída com amortecedor elevado de sal (10 milímetros de Tris-Cl (pH 7.5), NaCl de 0.5 M, 3 milímetros de MgCl2, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 milímetro DTT). O RNA purified de cada fração pela solução do STAT do RNA. O RNA total foi isolado usando o reagente RNA-STAT60 (Telefone-teste) de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. (Referência: Byeong-Churl Jang e outros, 2002)
Para 100 mls 200 mls
4. o EDTA 0.5M de g 106.4 2% N-lauroylsarcosine do thiocyanate 53.2 de 5M Guanidinium (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mM 10 mls 20 mls 25mM Tris-HCl, pH 7.5 1M 2.5 mls 5 mls
0. b-mercaptoethanol 700ul 1.4mls de 1M
0. antiespumas A de 2% (Sigma) 200 ul do ul 400
5. volume final do cushion* de 7 M CsCl 100 ml
5. 7 M CsCl “cozido” 95.8g
0. o EDTA 0.5M de 1M 20 mls
* Use a água tratada DEPC e produtos vidreiros cozidos. Esta solução, absolutamente, positivamente deve ser Rnase livre. O Rnase está em toda parte! Desgaste luvas, produtos vidreiros cozidos do uso somente, ou o plástico virgem. Deleite de DePC sua água, amortecedores (exceto Tris). Seja muito cuidadoso.
1. Pese o animal. Remova o órgão (fígado), torne mais pesado um dos atributos superiores do cDNA é você reduzem a complexidade do gene escolhendo um órgão que expresse somente um único locus de uma enzima do multilocus. 2. Homogeneize o tecido ràpida na rotação 3. do amortecedor do “caos” (9mls) homogenant em 12 quilogramas para remover o material insolúvel 4. QUANDO Homogenant GIRAR 4A. Torne mais pesados para fora 1.8 g de CsCl (0.2g/ml) por a amostra. 4B. No tubo do ultra-centrifuge (“rápido-selo”) adicione 3.5mls de 5.7M CsCl “coxim” que esta camada deve ser Rnase livre. Você centrifugará seu RNA com esta camada e toda a contaminação causará perdas significativas. 5. Remova supernant, põr no tubo fresco, adicione 1.8 g CsCl 6. com cuidado, adicione homogenant sobre o coxim de CsCl. Isto é o mais prontamente realizado usando uma seringa 10cc e uma agulha longa. Coloc a agulha/seringa no tubo do rápido-selo, e adicione o tecido homogenant à seringa. Homogenant gotejará lentamente no tubo de Q-S, flutuando sobre o coxim.
7. Com cuidado, pares combinados do contrapeso de tubo de centrifugador (+-0.005 g).
8. Tubos de selo, oposto combinado lugar dos tubos de se e tampão com partes superiores de alumínio vermelhas.
9. Centrifugador, 50.000 rpms 5.5 horas, 20oC
Após a centrifugação: Marque os tubos onde a pelota deve estar: no lado exterior inferior (relativo ao centro do rotor)
10. Remova os tubos, coloc na cremalheira conveniente.
11. Corte fora da parte superior do tubo. Aspire fora do 2/3- superior 3/4 da solução. TRABALHE DA PARTE SUPERIOR PARA BAIXO. É IMPORTANTE QUE VOCÊ ASPIRA FORA DA PARTE SUPERIOR A MAIORIA DE SOLUÇÃO PRIMEIRAMENTE E REMOVE TUDO MAS O COXIM DESOBSTRUÍDO. NÃO ASPIRE A PELOTA INVISÍVEL NA PARTE INFERIOR.
12. Elimine o 2/3 superior do tubo. Usando um Pasteur “puxado” introduza com pipeta, remova com cuidado solução restante. A pelota estará no bottom-side do tubo.
13. Enxágüe a pelota com 70% EtOH, remova-a (o uso Pasteur introduz com pipeta), repita-a duas vezes (o total 3 lava)
14. Adicione ul 200 de 0.1x TE (RNase livre), usando a ponta introduzir com pipeta à pelota do esmagamento e “titrating” a tentativa do T.E. de põr a pelota na solução. Dê forma pelo menos a uma solução heterogênea e põr em um tubo fresco do microfuge.
15. Repita com o ul 200 do T.E. que associa ambas as soluções
16. O Vortex, bom RNA não gosta de entrar na solução. A paciência é uma virtude.
17. Determine a concentração, ul 10 em ul 490 (500 ul os vol finais)
18. Removem 1 a 2 ug do RNA para a análise do gel (adicionam amortecedores do carregamento do RNA)
19. Adicionam o Rnase 3M livre NaOAC de 1/10 de volume (40 ul), 2.5 volumes de EtOH (1.0ml). Mistura vigorosa.
20. Você não pode calcular a concentração de RNA no EtOH.Thus, lá é nenhuma necessidade de precipitar imediatamente todo seu RNA. Apenas remova aproximadamente 1.5 a 2 vezes a quantidade que você precisa vortexing a solução de EtOH/RNA e remova o volume apropriado. Esta solução de EtOH/RNA armazenada em 20oC ou abaixa, é estável por anos.
Veja:
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