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Biologia Molecular - Citações Da Ciência

A pesquisa é o que eu estou fazendo quando eu não sei o que eu estou fazendo. ~Wernher Von Braun

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Bornes Recentes Do Forum

Isolação do RNA

Informação De Fundo Da Extração do RNA

Obtendo a qualidade elevada, o RNA intato é o primeiro e frequentemente a etapa a mais crítica em executar muito biologia molecular fundamental experimenta, including a análise do norte, assays da proteção do nuclease, RT-PCR, RNA que traça, na construção da tradução de vitro e da biblioteca do DNA. Ser bem sucedido, entretanto, o procedimento da isolação do RNA deve incluir algumas etapas importantes ambas before.and.after o purification real do RNA.

Métodos Básicos Da Isolação do RNA

Dependendo do RNA a ser extraído, há as propriedades do RNA que permitem que seja isolado afastado de outros materiais celulares tais como proteínas, DNA e mesmo lipids.

O RNA ou o mRNA do mensageiro contêm resíduos de uma adenosina do estiramento no formulário de uma cauda do poly(A). Isto foi explorado para permitir que o mRNA seja limitado às colunas ou aos grânulos da afinidade do poly(T).

Pontas para a extração e a isolação do RNA

Se você tiver atualmente um método preferido para isolar o RNA, continue a usá-lo.

Se você não isolar o RNA de seu sistema antes que e seu organismo não esteja na seguinte lista, nós podemos ajudar-lhe identificar os protocolos estabelecidos que foram usados isolando o RNA para borrar do norte ou o RT-PCR de seu sistema. Estes tipos de protocolos renderão também o RNA da "microarray-classe".

Funcione sempre um gel do agarose de seu RNA para avaliar a qualidade.

NOTA: Se você usar non um reagent baseado coluna do purification tal como TRIzol que nós o recomendamos precipitate seu RNA uma segunda vez do ethanol ou você passa-o através de uma coluna de Rneasy ou de um dispositivo similar. Isto segura a remoção de todos os contaminadores orgânicos (veja spectra abaixo).

Inibidores do rNase usados na extração e na isolação do RNA

Verificando a qualidade e a quantidade da isolação do RNA

O fractionation eficiente de nuclear/cytoplasmic pode rapidamente ser avaliado pela análise desnaturando do gel do agarose (veja figura 1). As faixas que correspondem ao rRNA do precursor devem ser equivalentes na fração total e nuclear do RNA. As faixas do rRNA 18S e 28S serão mais menos intensas na fração nuclear do RNA do que no RNA do total ou no RNA cytoplasmic da fração. Em algumas linhas da pilha, para as pilhas 293 e COS-7 do exemplo, esta diferença será dramática, mas em outras linhas das pilhas tais como pilhas heLa, as faixas do rRNA são somente ligeiramente mais menos intensas no RNA nuclear do que no RNA total ou cytoplasmic da fração."

Purity do RNA

As leituras A260 e 260/280 das relações não são bastantes para assegurar o RNA do purity elevado. Você deve fazer exame de um spectrum UV cheio. Abaixo estão 3 spectra do exemplo que todos têm 260/280 bom das relações, mas têm purities muito diferentes. Você pode também usar a relação de 260/230 à ajuda determina a quantidade de contaminação orgânica em seu RNA. É um número muito mais variável do que a relação de 260/280, mas geralmente, as relações acima de 1 indicam o purity bom.

Quantifying a extração e a isolação do RNA

Isolação do RNA das frações subcellular

As pilhas foram lavadas então em PBS e extraíram sucessivamente como descritas. Primeiramente, as pilhas foram extraídas com o amortecedor de Nonidet P-40 (10 milímetros de Tris-tris-Cl, (pH 7.5), 10 milímetros de NaCl, 3 milímetros de mgCl2, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 milímetro DTT). A pelota restante (reticulum endoplasmic áspero (RER) e núcleo) foi lavada no mesmo amortecedor e extraída no amortecedor B (10 milímetros de Tris-tris-Cl (pH 7.5), 10 milímetros de NaCl, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, EDTA de 40 milímetros, 40 units/ml Rnasin, 1 milímetro DTT). A pelota nuclear restante foi lavada no mesmo amortecedor e extraída com amortecedor elevado de sal (10 milímetros de Tris-tris-Cl (pH 7.5), NaCl de 0.5 M, 3 milímetros de mgCl2, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 milímetro DTT). O RNA purified de cada fração pela solução do STAT do RNA. O RNA total foi isolado usando o reagent RNA-STAT60 (Telefone-teste) de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. (referência: Byeong-Churl Jang et al., 2002)

Isolação do RNA Usando O Protocolo De CsCl

Amortecedor do caos para a isolação do RNA

Para 100 mls 200 mls

4. EDTA 0.5M de g 106.4 2% N-lauroylsarcosine do thiocyanate 53.2 de 5M Guanidinium (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mM 10 mls 20 mls 25mM Tris-HCl, mls do 1M 2.5 do pH 7.5 5 mls

0. b-b-mercaptoethanol 700ul 1.4mls do 1M

0. antifoam A de 2% (sigma) 200 ul do ul 400

5. coxim de 7 M CsCl * volume final 100 ml

5. 7 M CsCl "Cozido" 95.8g

0. EDTA 0.5M do 1M 20 mls

Procedimento Da Extração do RNA Usando CsCl

* Use a água tratada DEPC e o glassware cozido. Esta solução, absolutamente, positivamente deve ser rnase livre. O rnase está em toda parte! Desgaste luvas, o glassware cozido do uso somente, ou o plástico virgem. Deleite de DePC sua água, amortecedores (exceto Tris). Tenha muito cuidado.

1. Pese o animal. Remova o órgão (fígado), torne mais pesado um dos atributos superiores do DNA é você reduzem a complexidade do gene escolhendo um órgão que expresse somente um único locus de um enzyme do multilocus. 2. Homogenize o tecido ràpidamente no amortecedor do "caos" (9mls) 3. Gire homogenant em 12 quilogramas para remover o material insoluble 4. QUANDO Homogenant GIRAR 4A. Torne mais pesado para fora de 1.8 g de CsCl (0.2g/ml) por a amostra. 4B. No tubo do ultra-centrifuge ("rápido-selo") adicione 3.5mls de 5.7M CsCl "coxim" que esta camada deve ser rnase livre. Você centrifuge seu RNA com esta camada e toda a contaminação causará perdas significativas. 5. Remova supernant, posto no tubo fresco, adicione 1.8 g CsCl 6. Com cuidado, adicione homogenant no alto do coxim de CsCl. Isto é o mais prontamente realizado usando um syringe 10cc e uma agulha longa. Coloque needle/syringe no tubo do rápido-selo, e adicione o tecido homogenant ao syringe. Homogenant trickle lentamente no tubo de Q-S, flutuando no alto do coxim.

7. Com cuidado, o contrapeso combinou pares do tubo de centrifugador (+-0.005 g).

8. Tubos de selo, oposto combinado lugar dos tubos de se e tampão com altos de alumínio vermelhos.

9. Centrifugador, 50.000 rpms 5.5 horas, 20oC

Após o centrifugation: Marque os tubos onde a pelota deve estar: no lado exterior inferior (relativo ao centro do rotor)

10. Remova os tubos, coloque-os na cremalheira conveniente.

11. Corte fora do alto de tube.Aspirate fora do 2/3- superior 3/4 da solução. TRABALHE DO ALTO PARA BAIXO. É IMPORTANTE QUE VOCÊ ASPIRATE FORA DA PARTE SUPERIOR A MAIORIA DE SOLUÇÃO PRIMEIRAMENTE E REMOVE TUDO MAS O COXIM DESOBSTRUÍDO. NÃO ASPIRATE A PELOTA INVISÍVEL NO FUNDO.

12. Corte fora o 2/3 superior do tubo. Usando um Pasteur "puxado" introduza com pipeta, remova com cuidado solução restante. A pelota estará no fundo-lado do tubo.

13. Enxágüe a pelota com 70% EtOH, remova-a (o uso Pasteur introduz com pipeta), repita-a duas vezes (o total 3 se lava)

14. Adicione ul 200 de 0.1x TE (rNase livre), usar-se introduzem com pipeta a ponta para esmagar a pelota e "titrating" a tentativa de T.E. de pôr a pelota na solução. Dê forma ao menos a uma solução heterogênea e ponha-a em um tubo fresco do microfuge.

15. Repita com o ul 200 de T.E. que pooling ambas as soluções

16. O vortex, RNA bom não gosta de entrar na solução. A paciência é um virtue.

17. Determine a concentração, ul 10 em ul 490 (500 ul vol final)

18. Remova 1 a 2 ug do RNA para a análise do gel (adicione amortecedores do carregamento do RNA)

19. Adicione o rnase livre 3M NaOAC de 1/10 de volume (ul 40), os 2.5 volumes EtOH (1.0ml). Mistura vigorosa.

20. Você não pode calcular a concentração do RNA EtOH.Thus, lá é nenhuma necessidade precipitate todo seu RNA em uma vez. Apenas remova aproximadamente 1.5 a 2 vezes a quantidade que você necessita vortexing a solução EtOH/RNA e remova o volume apropriado. Esta solução EtOH/RNA armazenada em 20oC ou abaixa, é estável por anos.

Veja: