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Gels do RNA

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History do electrophoresis do gel do RNA

Os gels do RNA foram usados por décadas separar para fora e avaliar qualitatively a qualidade do RNA isolada das amostras. Se você não for certo que RNA é verificação geral:

AUDIO Escute uma explanação detalhada do RNA! e veja nosso artigo da enciclopédia do RNA.

Electrophoresis Do Gel do RNA - Informação De Fundo

Após a isolação de amostras do RNA, a qualidade da preparação isolada do RNA é avaliada geralmente pelo electrophoresis em um gel desnaturando do agarose. Embora os resultados sejam principalmente qualitative, você pode começar alguma informação sobre o rendimento do RNA também.

Desnaturando gels são usados porque o RNA tende a se dobrar em cima dse e a dar forma à estrutura secundária extensiva e estável através de se emparelhar baixo intramolecular. Esta estrutura secundária do RNA impede que migre principalmente de acordo com seu tamanho.

Certifique-se de que você inclui um controle positivo do RNA no gel, no caso que você começa resultados que incomuns você pode então determinar se o problema era com o gel ou era um problema com o RNA você está analisando. Você pode também usar marcadores do peso molecular do RNA, uma amostra do RNA sabida para ser intato, ou ambos, podem ser usados para esta finalidade.

Os gels do RNA estão visualizados com o brometo de ethidium que mancha enquanto o brometo de ethidium intercala entre a estrutura secundária das moléculas do RNA e permite que o RNA seja visto sob a luz UV.

O RNA é separado para fora pelo electrophoresis do gel (geralmente electrophoresis do gel do agarose). Após ter funcionado um gel do RNA você pode conduzir um borrão do norte com transferência subseqüente à membrana, ao hybridization com ponta de prova, e finalmente à deteção. Ou simplesmente (e muito mais rápido), mancha para o RNA usando o brometo de ethidium ou o SYBR (ou tintura similar - melhor como ela é non-toxic e mais seguro).

 

Aplicações de gels do RNA

Porque os borrões do norte são muito mais tedious de terminar do que gels do RNA e PCR real-time, não são usados tanto quanto gels do RNA.

O electrophoresis do gel do RNA e suas variações são usados na pesquisa molecular da biologia:

• detecte o RNA
• assay para a qualidade do RNA isolada
• permita a determinação geral da quantidade ou do rendimento do RNA
• assay para a degradação do RNA

Desvantagens de gels do RNA

As desvantagens de usar o electrophoresis do gel do RNA incluem:

• Os gels do RNA não são muito quantitative. Você não pode determinar precisamente o rendimento do RNA ou atingir mesmo com padrões. Os métodos radioativos tais como borrões do norte borrar ou de ponto são muito mais exatos.
• O brometo de ethidium é usado frequentemente detectar o RNA. O brometo de ethidium é um biohazard porque é mutagenic e tóxico.
• Os gels do RNA permitem uma determinação rápida do rendimento do RNA entretanto não são tão rapidamente quanto o spectrophotometry UV ou os outros métodos.

Vantagens de gels do RNA

As vantagens de gels do RNA incluem:

• É um método extensamente aceitado
• Os gels do RNA são muito rápidos e fáceis executar
• Você pode assay para a qualidade do RNA dentro de 1-2 horas
• Se você usar SYBR ou uma outra mancha non-toxic (isto é você não usa o brometo de ethidium), os gels do RNA são completamente seguros.

Protocolo Do Gel do RNA

Para verificar a integridade de seu RNA você deve fazer "uma análise do borrão do norte ". A fim realizar este você deve funcionar um gel desnaturando.

Para Mini-mini-gels aos Midi-midi-gels do uso do RNA: Faça 50 mL-100mL

Para Mega-mega-gels faça 400 mL.

 

Para o gel 100mL (funcionado o mais geralmente) você necessita adicionar 1g do agarose para fazer a solução do agarose de 1%.

 

Receita running do amortecedor para gels do RNA

Para preparar-se:	500mls	750 mls	1.5 litro
amortecedor do 1X E (50X)-below	10 mL	15 mL	30 mL
formaldehyde de 0.66M (1/19 do vol)	26.3 mL	39.5 mL	79 mL

RNA Que Desnatura Reagents

Para preparar 400ul do RNA que desnatura o reagent:

Adicione o seguinte:

• 300ul Foramide-foramide-deionized 80%
• 3.7 % do ul do formaldehyde 40
• ul do amortecedor 8 do 1X 50X E
• dH2O = 400ul 52ul

amortecedor de 50 X E por o litro

Adicione:

• 0.9 M Na2 HPO4 127.8 dibasic g
• 0.1M NaH2PO4 g 13.8 monobasic

Protocolo: Etapas em preparar um gel do RNA

1. ponha o agarose nas soluções.
2. Aqueça a solução preparada no flask tecido-tissue-plugged
3. Deixe fresco a 60°C
4. Adicione o formaldehyde ao igual 0.66M 2.7 ml 4.0 5.3 21.2
5. (adicione o brometo de ethidium se você o estiver usando ao flask)
6. Derrame o gel (na capa se possível).
7. Aqueça 2 ug do RNA em 75°C por 10 min., a seguir esfrie-os rapidamente (isto permitirá que o RNA desnature e permaneça único-encalhado).
8. Adicione: 2.5 vol do RNA que desnaturam o reagent
9. Adicione 1/10 de vol. da tintura do carregamento às amostras.
10. Carregue amostras em poços do gel do agarose.
11. Funcione o gel (geralmente volts 100V) por as horas 30minutes-2. (RNA da verificação que funciona usando marcadores da tintura)

Pontas para gels do RNA

Funcione sempre um gel do agarose de seu RNA para avaliar a qualidade. Confiam não somente somente os resultados UV do spectrophotometry.

* Use a água tratada DEPC e o glassware cozido para todas as etapas. Os amortecedores devem ser rnase livre ou usar a água purified Milipore se você for no arremetidas. O rnase está em toda parte! Desgaste luvas, o glassware cozido do uso somente, ou o plástico virgem. Deleite de DePC sua água, amortecedores (exceto Tris). Tenha muito cuidado.

 

Gels De Pesquisa de defeitos do RNA

Se você tiver atualmente um método preferido para funcionar o RNA, continue a usá-lo.

Discuta e problema ou perguntas do borne sobre gels do RNA no forum dos protocolos do RNA.

Referências Do Gel do RNA