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Geles do RNA

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História da electroforese do gel do RNA

Os geles do RNA foram usados por décadas para separar para fora e para avaliar qualitativa a qualidade do RNA isolada das amostras. Se você não é certo que RNA é verificação geral:

O ÁUDIO escuta uma explanação detalhada do RNA! e veja nosso artigo da enciclopédia do RNA.

Electroforese do gel do RNA - informação de fundo

Após a isolação de amostras do RNA, a qualidade da preparação isolada do RNA é avaliada geralmente pela electroforese em um gel de desnaturalização do agarose. Embora os resultados sejam principalmente qualitativos, você pode começ alguma informação sobre o rendimento do RNA também.

Desnaturando geles são usados porque o RNA tende a se dobrar em cima dse e a dar forma à estrutura secundária extensiva e estável através do emparelhamento baixo intramolecular. Esta estrutura secundária do RNA impede que migre principalmente de acordo com seu tamanho.

Certifique-se de que você inclui um controle positivo do RNA no gel, no caso em que você começ resultados incomuns você pode então determinar se o problema era com o gel ou era um problema com o RNA que você está analisando. Você pode igualmente usar marcadores do peso molecular do RNA, uma amostra do RNA conhecida para ser intato, ou ambos, podem ser usados com esta finalidade.

Os geles do RNA estão visualizados com o brometo de ethidium que mancha enquanto o brometo de ethidium intercala entre a estrutura secundária das moléculas do RNA e permite que o RNA seja visto sob a luz UV.

O RNA é separado para fora pela electroforese do gel (geralmente electroforese do gel do agarose). Após ter funcionado um gel do RNA você pode conduzir um borrão do norte com transferência subseqüente à membrana, à hibridação com ponta de prova, e finalmente à deteção. Ou simplesmente (e muito mais rápido), mancha para o RNA usando o brometo de ethidium ou o SYBR (ou tintura similar - melhor como ela é non-toxic e mais seguro).

Aplicações de geles do RNA

Porque os borrões do norte são muito mais fastidiosos de terminar do que geles do RNA e PCR do tempo real, não são usados tanto quanto geles do RNA.

A electroforese do gel do RNA e suas variações são usadas na pesquisa da biologia molecular:

• detecte o RNA
• ensaio para a qualidade do RNA isolada
• permita a determinação geral da quantidade ou do rendimento do RNA
• ensaio para a degradação do RNA

Desvantagens de geles do RNA

As desvantagens de usar a electroforese do gel do RNA incluem:

• Os geles do RNA não são muito quantitativos. Você não pode determinar precisamente o rendimento do RNA ou atingir mesmo com padrões. Os métodos radioativos tais como borrões da mancha do norte ou do ponto são muito mais exatos.
• O brometo de ethidium é usado frequentemente para detectar o RNA. O brometo de Ethidium é um biohazard porque é mutagénico e tóxico.
• Os geles do RNA permitem uma determinação rápida do rendimento do RNA entretanto não são tão rapidamente quanto a espectrofotometria UV ou os outros métodos.

Vantagens de geles do RNA

As vantagens de geles do RNA incluem:

• É um método extensamente aceitado
• Os geles do RNA são muito rápidos e fáceis executar
• Você pode analisar para a qualidade do RNA dentro de 1-2 horas
• Se você usa SYBR ou uma outra mancha non-toxic (isto é você não usa o brometo de Ethidium), os geles do RNA são completamente seguros.

Protocolo do gel do RNA

Para verific a integridade de seu RNA você deve fazer “uma análise do borrão do norte”. A fim realizar este você deve funcionar um gel de desnaturalização.

Para Mini-geles aos Midi-geles do uso do RNA: Faça 50 mL-100mL

Para Mega-geles faça 400 mL.

Para o gel 100mL (funcionado o mais geralmente) você precisa de adicionar 1g do agarose para fazer a solução do agarose de 1%.

Receita Running do amortecedor para geles do RNA

RNA que desnatura reagentes

Para preparar 400ul do RNA que desnatura o reagente:

Adicione o seguinte:

• 300ul Foramide-deionized 80%
• ul do formaldehyde 40 de 3.7%
• ul do amortecedor 8 de 1X 50X E
• dH2O = 400ul 52ul

Amortecedor de 50 X E por o litro

Adicione:

• 0.9 M Na2 HPO4 127.8 Dibasic g
• 0.1M NaH2PO4 g 13.8 Monobasic

Protocolo: Etapas em preparar um gel do RNA

1. põr o agarose nas soluções.
2. Aqueça a solução preparada na garrafa tecido-obstruída
3. Deixe fresco a 60°C
4. Adicione o Formaldehyde para igualar 0.66M 2.7 ml 4.0 5.3 21.2
5. (Adicione o brometo de Ethidium se você o está usando à garrafa)
6. Derrame o gel (na capa se possível).
7. Aqueça 2 ug do RNA em 75°C por 10 Min., então rapidamente fresco. (isto permitirá que o RNA desnature e permaneça single-stranded).
8. Adicione: 2.5 vol do RNA que desnaturam o reagente
9. Adicione 1/10 de Vol. da tintura do carregamento às amostras.
10. Carregue amostras em poços do gel do agarose.
11. Funcione o gel (geralmente volts 100V) por as horas 30minutes-2. (RNA da verificação que funciona usando marcadores da tintura)

Pontas para geles do RNA

Funcione sempre um gel do agarose de seu RNA para avaliar a qualidade. Confiam não somente somente os resultados UV da espectrofotometria.

* Use a água tratada DEPC e produtos vidreiros cozidos para todas as etapas. Os amortecedores devem ser Rnase livre ou usar a água purified Milipore se você está em uma arremetida. O Rnase está em toda parte! Desgaste luvas, produtos vidreiros cozidos do uso somente, ou o plástico virgem. Deleite de DePC sua água, amortecedores (exceto Tris). Seja muito cuidadoso.

Geles do RNA da pesquisa de defeitos

Se você tem atualmente um método preferido para funcionar o RNA, continue a usá-lo.

Discuta e problema ou perguntas do borne sobre geles do RNA no fórum dos protocolos do RNA.

Referências do gel do RNA

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