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Biologia Molecular - Citações Da Ciência

Mas quanto para a determinada verdade, nenhum homem soube-a, nem sabê-la-á; nem dos deuses, nem contudo de todas as coisas de que eu falo. E mesmo se por acaso devia expressar a verdade final, ele mesmo não a saberia; Para é mas todo um Web tecido das suposições. ~Xenophanes (c. 570-c. 480 BCE) Filósofo grego.

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Borrão Do norte

Copyright 2007 - Estação Molecular

AUDIO emita a um amigo Escute uma explanação do norte detalhada do borrão!

History de borrar do norte

Borrar do norte é uma técnica borrando do RNA que seja desenvolvida em 1977 por Alwine et por al. na universidade de stanford (ref:1). Foi nomeado após a técnica do sul do borrão que borra para o DNA, inventada por Edwin M. Do sul em 1975. O borrão ocidental, um método para borrar para proteínas é também um jogo no borrão do sul que nomeia e foi nomeado em 1981 (ref:2).

Informação De Fundo - Técnica Do norte Do Borrão

A análise do norte apesar de sua idade no mundo do tech elevado do tempo real PCR, dos assays da proteção do nuclease (RPAs) e dos microarrays, é ainda a ouro-padrão para a deteção e o quantitation de níveis do mRNA. Isto é porque a análise do norte do borrão permite uma comparação direta da abundância do RNA do mensageiro entre amostras em uma única membrana.

No borrão do norte a diferença principal entre as outras técnicas borrando é que o RNA é o fator que está sendo detectado. Também, devido ao fato que o RNA único-está encalhado geralmente, cría as estruturas secundárias complexas que afetam sua migração e daqui desnaturando circunstâncias são usados funcionar os gels (ao contrário de do sul).

O RNA é separado para fora pelo electrophoresis do gel de RNA (geralmente electrophoresis do gel do agarose), por transferência subseqüente à membrana, pelo hybridization com ponta de prova, e finalmente pela deteção.

Français

 

 

Similarmente a borrar do sul, as pontas de prova do hybridization podem ser DNA ou RNA em borrar do norte.

Um variant do procedimento sabido como o borrão do norte reverso ocasionalmente (embora, infrequëntemente) foi usado. Neste procedimento, a carcaça que o ácido nucleic (que affixed à membrana) é uma coleção de fragmentos isolados do DNA, e a ponta de prova é RNA extraído de um tecido e etiquetado radioativa.

O uso dos microarrays do DNA que vieram em uso difundido nos 1990s atrasados e no 2000s adiantado é mais akin ao procedimento reverso, que envolvem o uso dos fragmentos isolados do DNA affixed a uma carcaça, e ao hybridization com uma ponta de prova feita do RNA celular. Assim o procedimento reverso, embora originalmente uncommon, permitido o estudo do um-em-um-tempo da expressão do gene usando a análise do norte evoluir na expressão do gene que perfila, em que muitos (possivelmente tudo) dos genes em um organismo podem ter sua expressão monitorada

Aplicações do borrão do norte

Os borrões do norte foram superceded em a maioria de áreas por Real Tempo PCR e aproximações microarray. Não é usado frequentemente para finalidades clínicas ou diagnósticas.

O protocolo do norte do borrão e suas variações são usados entretanto na pesquisa molecular da biologia:

Desvantagens de borrar do norte

As desvantagens de usar borrar do norte incluem:

Vantagens de borrar do norte

As vantagens de borrões do norte incluem:

Protocolo Do norte Do Borrão

Como mencionado as etapas em borrar do norte incluem:

  1. Isolação do RNA
  2. Electrophoresis do gel do RNA para a separação
  3. Transferência à membrana (o nylon geralmente positivamente carregado como o RNA é carregado negativamente)
  4. Cross-linking do RNA à membrana (geralmente por meios UV-uV-crosslinking ou de produto químico)
  5. Hybridization
  6. Deteção

Os materiais necessitaram para o protocolo do norte do borrão

Receitas Do Amortecedor

20XSSPE (500 ml)
Amortecedor de phosphate pH7.0 (500ml)
Amortecedor do hybridization = HB (100mls)

 

* * Direito antes de usar-se adicione o RNA desnaturado 1000ug do fermento 5000ug do DNA do rNAse livre CT (calor a 95o por 3 minutos a desnaturar)

 

LAVAGEM: 2X SSPE + 0.1% SDS (500 mls) 50 mls dos mls 20X 5 10% SDS = 0.1% SDS

Amortecedor running para o gel do RNA (1L)
Gel do RNA (70ml)

Amostras do RNA para o borrão do norte

Veja a isolação e o purification do RNA

Gel do RNA

Após ter isolado o RNA, o RNA deve ser separado para fora em um gel (geralmente agarose).

veja gels do RNA

Transferência do norte do borrão ao protocolo de nylon da membrana

Após ter funcionado o gel do RNA, lave o gel com água destilada posta sobre o posiblotter.

As camadas do alto ao fundo são:

A braçadeira sobre e certifica-se que há um selo bom. Use 75-80 milímetros hectograma da pressão para 1 hora ou mais.

Borre a membrana seca

Membranas De nylon Do Cross-linking - Protocolo Do norte Do Borrão

Pre hybridization para o borrão do norte

  1. Hybridize pre por 6 horas-durante a noite
  2. Ajuste o forno 65°C ao amortecedor do calor HB para pôr o SDS na solução
  3. Role acima a membrana dentro da parte de engranzamento e ponha-a no hybridizaton tube(2X SSPE/0.1%SDS)
  4. Verifique para ver se há bolhas de ar
  5. Ponha o tubo no forno balançado com um outro tubo sobre o lado oposto

Ponta de prova etiquetando para borrar do norte

  1. Ponha 25ng da ponta de prova em um volume total de 11uL com ddH2O
  2. Desnature @ 95°C 3 minutos. Este é começar à ponta de prova único encalhado e remover a estrutura secundária que impediria o hybridization eficiente.
  3. Esfrie rapidamente no gelo molhado. Este é manter único encalhado da ponta de prova, livre da estrutura secundária e não o reservar reannealing (ou reformar de estruturas secundárias).
  4. Adicione total radiolabeled (Boehringer Mannheim) 5ul do alfa 4ul altamente principal P-32 dCTP 3000uCi/mmole 20ul
  5. Incubate 10-15 37°C mínimos
  6. Adicione 28uL do 1X TE, EDTA de 2ul 0.5M, à reação 20ul.
  7. Pre-gire a coluna de G-25 Sephadex para 1 minuto.
  8. Adicione a amostra 50ul à coluna e gire-a por 2.5 minutos no centrifugador clínico. Este é purify a ponta de prova away da etiqueta.
  9. Do throw coluna afastado.
  10. Misture em um RNA novo do fermento do tubo 100ug CT-DNA 50ug em um tubo 0.5mL.
  11. Desnature 95° 3 minutos
  12. Adicione à mistura hybrid do tubo, hybridize em 65°C por 20-36 horas

Afixe o protocolo do hybridization para borrar do norte

Hybridize por 36-48 horas lavam-se então.

  1. Aqueça acima do calor de 2X SSPE/0.1% SDS (lavagem) até 65° C (banho da microonda ou da água do uso para aquecer a solução)
  2. Remova o tubo e derrame o líquido no recipiente waste radioativo quente.
  3. A enxaguadura com lavagem 10ml faz esta duas vezes e derrama o desperdício para fora.
  4. Posto em 40 a 50 mls da lavagem e da agitação vigoursly.
  5. Posto no forno do hybridization para girar 20 mínimo.
  6. Derrame abaixo o dissipador
  7. Um outro 40-50mls e agitação no forno.
  8. Derrame para fora ao recipiente waste (dissipador if.not quente ou tóxico) e certifique-se que está um quente não mais longo e remove então a membrana.
  9. Lave no shaker com o 0.2XSSPE com 0.1% SDS no RT por 15 minutos.
  10. Areje seco
  11. Exposição

 

Pontas para o borrão do norte

Se você tiver atualmente um método preferido para isolar o RNA, continue a usá-lo.

Funcione sempre um gel do agarose de seu RNA para avaliar a qualidade. Confie não somente em resultados do spectrophotometry.

* Use a água tratada DEPC e o glassware cozido. Esta solução, absolutamente, positivamente deve ser rnase livre. O rnase está em toda parte! Desgaste luvas, o glassware cozido do uso somente, ou o plástico virgem. Deleite de DePC sua água, amortecedores (exceto Tris). Tenha muito cuidado.

 

Borrões Do norte De Pesquisa de defeitos

Se você tiver atualmente um método preferido para isolar o RNA, continue a usá-lo.

 

Discuta e afixe perguntas sobre isto no forum do norte do borrão.

Referências Do norte Do Borrão

  1. Alwine JC, Kemp DJ, GR Stark (1977). o "método para a deteção de RNAs específico no agarose gels por transferência ao diazobenzyloxymethyl-papel e o hybridization com DNA sonda". Proc. Natl. Acad. Sci. EUA. 74 (12): 5350-4.
  2. W. Neal Burnette (Abril 1981). "' borrar ocidental ': transferência electrophoretic das proteínas dos gels de polyacrylamide do sulfate — dodecyl de sodium a nitrocellulose unmodified e da deteção radiographic com antibody e radioiodinated a proteína A ". Biochem Anal 112 (2): 195-203.


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