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Borrão do norte

Direitos reservados 2007 - Estação molecular

O ÁUDIOÁudio da biologia molecularescuta uma explanação do norte detalhada do borrão!

História da mancha do norte

A mancha do norte é uma técnica de mancha do RNA que seja desenvolvida em 1977 por Alwine e outros na Universidade de Stanford (referência: 1). Foi nomeada após a técnica do sul do borrão que borra para o ADN, inventada por Edwin M. do sul em 1975. O borrão ocidental, um método para borrar para proteínas é igualmente um jogo no borrão do sul que nomeia e foi nomeado em 1981 (referência: 2).

Informação de fundo - técnica do norte do borrão

A análise do norte apesar de sua idade no mundo alta tecnologia do PCR do tempo real, dos ensaios da proteção da nuclease (RPAs) e dos microarrays, é ainda a ouro-padrão para a deteção e a quantificação de níveis do mRNA. Isto é porque a análise do norte do borrão permite uma comparação direta da abundância do RNA de mensageiro entre amostras em uma única membrana.

No borrão do norte a diferença principal entre as outras técnicas de mancha é que o RNA é o fator que está sendo detectado. Também, devido ao fato de que o RNA é geralmente single-stranded, cria as estruturas secundárias complexas que afetam sua migração e daqui desnaturando circunstâncias são usados para funcionar os geles (ao contrário de do sul).

O RNA é separado para fora pela electroforese do gel de RNA (geralmente electroforese do gel do agarose), por transferência subseqüente à membrana, pela hibridação com ponta de prova, e finalmente pela deteção.

borrão do norte

 

 

Similarmente à mancha do sul, as pontas de prova da hibridação podem ser ADN ou RNA na mancha do norte.

Uma variação do procedimento conhecido como o borrão do norte reverso ocasionalmente (embora, infrequëntemente) foi usada. Neste procedimento, a carcaça que o ácido nucleico (de que é afixado à membrana) é uma coleção de fragmentos isolados do ADN, e a ponta de prova é RNA extraído de um tecido e etiquetado radioativa.

O uso dos microarrays do ADN que entraram uso difundido no final dos anos 90 e no 2000s adiantado é mais aparentado ao procedimento reverso, que envolvem o uso dos fragmentos isolados do ADN afixados a uma carcaça, e à hibridação com uma ponta de prova feita do RNA celular. Assim o procedimento reverso, embora original raro, permitido o estudo do um-em-um-tempo da expressão de gene usando a análise do norte para evoluir na expressão de gene que perfila, em que muitos (possivelmente tudo) dos genes em um organismo podem ter sua expressão monitorada

Aplicações do borrão do norte

Os borrões do norte foram substituídos em a maioria de áreas por Tempo real PCR e por aproximações do microarray. Não é usado frequentemente para finalidades clínicas ou diagnósticas.

O protocolo do norte do borrão e suas variações são usados entretanto na pesquisa da biologia molecular:

  • um ouro-padrão para o estudo direto da expressão de gene a nível de mRNA (transcritos do RNA de mensageiro).
  • deteção do tamanho do transcrito do mRNA
  • degradação do RNA do estudo
  • emenda do RNA do estudo - pode detectar transcritos alternativamente emendados
  • estude o half-life do RNA
  • IRA do estudo (local ribosomal interno da entrada) - para remover a possibilidade de digestão do RNA contra a á tradução do cistron.
  • usado frequentemente para confirmar e verific ratos transgénicos/KO (animais)

Desvantagens da mancha do norte

As desvantagens de usar a mancha do norte incluem:

  • A radioactividade é usada frequentemente. Isto impede a facilidade de executar a, o uso e a eliminação. Os métodos novos da deteção non-radioactive foram gerados permitindo a deteção non-radioactive. Veja Pierce.
  • O processo inteiro de mancha do norte toma um tempo longo geralmente, da preparação da amostra completamente à deteção.
  • Se as amostras do RNA são degradadas mesmo ligeiramente por RNases, a qualidade dos dados e da quantificação da expressão é completamente negativamente afetada.
  • O método do norte padrão do borrão é relativamente menos sensível do que ensaios da proteção da nuclease e RT-PCR. A sensibilidade de borrões do norte pode ser aumentada com o uso das membranas positively-charged de nylon, uso de uma ponta de prova antisentido altamente específica.
  • A deteção com pontas de prova múltiplas é um problema. Frequentemente, as membranas devem ser descascadas antes da hibridação e da deteção com uma segunda ponta de prova. Este é um problema porque as circunstâncias ásperas são exigidas para descascar pontas de prova do borrão e são igualmente demoradas. Também, há um limite à quantidade de tempo que um borrão pode ser descascado.

Vantagens da mancha do norte

As vantagens de borrões do norte incluem:

  • É um método extensamente aceitado e bem considerado
  • a mancha do norte é um método direto
  • É usada frequentemente como uma confirmação ou uma verificação
  • Frequentemente um ouro-padrão
  • é um protocolo versátil porque pode permitir o uso de muitos tipos de incluir das pontas de prova (contra o PCR do tempo real): RNA e mesmo oligonucleotides radiolabeled e não-radiolabeled, in vitro transcritos tais como primeiras demão.
  • As seqüências com mesmo homology parcial, ao contrário do PCR do tempo real ou outros métodos podem ser usados como pontas de prova da hibridação (isto é a seqüência da espécie diferente para a análise do homology, ou mesmo fragmentos genomic pode ser usada).

Protocolo do norte do borrão

Como mencionado as etapas na mancha do norte incluem:

  1. Isolação do RNA
  2. Electroforese do gel do RNA para a separação
  3. Transferência à membrana (geralmente positivamente - o nylon carregado como o RNA é negativamente - carregada)
  4. Cross-linking do RNA à membrana (geralmente por meios do Uv-ligamento transversal ou do produto químico)
  5. Hibridação
  6. Deteção

Materiais necessários para o protocolo do norte do borrão

Receitas do amortecedor

20XSSPE (500 ml)
  • NaCl de 3.6M: 105.2 g
  • 0. 7.0:100 mL do pH do amortecedor de fosfato de 2M de 1M
  • o EDTA de 20mM: 20mL de 0.5M
Amortecedor de fosfato pH7.0 (500ml)
  • NaH2PO4 140 mL (monobasic) de 1M
  • Na2H2PO4 360 mL (Dibasic) de 1M
  • o pH a 7.0 após ambos é adicionado
=HB do amortecedor da hibridação (100mls)
  • 5X SSPE: 25mls 20X
  • 2% SDS: 20 mls 10%

 

* o *Right antes de usar adiciona o RNA desnaturado 1000ug do fermento 5000ug do ADN do CT do RNAse livre (calor a 95o para que o minuto 3 desnature)

 

LAVAGEM: 2X SSPE + 0.1% SDS (500 mls) 50 mls dos mls 20X 5 10% SDS= 0.1% SDS

Amortecedor Running para o gel do RNA (1L)
  • 100 ESPANADORES dos mls 10X
  • 52. 6 mls do formaldehyde
  • 847. 4 mls H20
Gel do RNA (70ml)
  • 0.84 agarose de g
  • 7 ESPANADORES dos mls 10x
  • 58.38 mls H2O
  • Põr o gel na solução pelo aquecimento. Deixe o gel fresco a 60°C, a seguir adicione o Formaldehyde para igualar 0.66M --3.78 mls
  • Derrame o gel na capa das emanações se possível

Amostras do RNA para o borrão do norte

Veja a isolação e a purificação do RNA

Gel do RNA

Após ter isolado o RNA, o RNA deve ser separado para fora em um gel (geralmente agarose).

veja geles do RNA

Transferência do norte do borrão ao protocolo de nylon da membrana

Após ter funcionado o gel do RNA, lave o gel com a água destilada põr sobre o posiblotter.

As camadas de de cima para baixo são:

  • esponja
  • 3-4 corte dos papéis de Whatman ao tamanho (ambos acima acima devem ser embebidos em 10X SSPE mas gotejamento)
  • máscara do gel.
  • Nota: Certifique-se das folhas de prova do gel a máscara de modo que possa selar a membrana com linha da parte superior do gel e o canto superior direito marque 3 partes de um plástico duro de papel ligeiramente mais grande de 3M com furos

A braçadeira sobre e certifica-se que há um bom selo. Use 75-80 milímetros hectograma da pressão para 1 hora ou mais.

Borre a membrana seca

Membranas de nylon do Cross-linking - protocolo do norte do borrão

  • Corte o envoltório superior do canto direito no envoltório de saran.
  • UV irradie com lado do RNA para baixo por 2.5 Min.
  • Lave por um par minutos na solução quente (solução de 2X SSPE/0.1% SDS da microonda por 30-45 segundos na potência de 50%.
  • Areje seco

Pre hibridação para o borrão do norte

  1. Cruze pre por 6 horas-durante a noite
  2. Ajuste o forno ao amortecedor do HB do calor 65°C para põr o SDS na solução
  3. Role acima a membrana dentro da parte de engranzamento e põr no tubo do hybridizaton (2X SSPE/0.1%SDS)
  4. Verific para ver se há bolhas de ar
  5. Põr o tubo no forno balançado com um outro tubo sobre o lado oposto

Ponta de prova de rotulagem para a mancha do norte

  1. Põr 25ng da ponta de prova em um volume total de 11uL com ddH2O
  2. Desnature @ 95°C 3 Min. Esta é começ à ponta de prova único encalhado e remover a estrutura secundária que impediria a hibridação eficiente.
  3. Esfrie rapidamente no gelo molhado. Esta é manter único encalhado da ponta de prova, livre da estrutura secundária e não a reservar reannealing (ou reformar de estruturas secundárias).
  4. Adicione (Boehringer Mannheim) 5ul P-32 o total radiolabeled alfa altamente principal do dCTP 4ul 3000uCi/mmole 20ul
  5. Incube 10-15 37°C mínimos
  6. Adicione 28uL de 1X TE, o EDTA de 2ul 0.5M, à reação 20ul.
  7. Pre-gire a coluna de G-25 Sephadex para 1 minuto.
  8. Adicione a amostra 50ul à coluna e gire-a para o minuto 2.5 no centrifugador clínico. Este é purify a ponta de prova longe da etiqueta.
  9. Do lance coluna afastado.
  10. Misture em um RNA novo do fermento do tubo 100ug CT-DNA 50ug em um tubo 0.5mL.
  11. Desnature o minuto de 95° 3
  12. Adicione à mistura híbrida do tubo, cruze em 65°C por 20-36 horas

Afixe o protocolo da hibridação para a mancha do norte

Cruze por 36-48 horas então de Washington.

  1. Aqueça acima o calor de 2X SSPE/0.1% SDS (lavagem) até 65° C (microonda ou o banho maria do uso para aquecer a solução)
  2. Remova o tubo e derrame o líquido no recipiente waste radioativo quente.
  3. A enxaguadura com lavagem 10ml faz esta duas vezes e derrama o desperdício para fora.
  4. Põr em 40 a 50 mls da lavagem e da agitação vigoursly.
  5. Põr no forno da hibridação para o giro 20 mínimo.
  6. Derrame abaixo do dissipador
  7. Um outro 40-50mls e agitação no forno.
  8. Derrame para fora ao recipiente waste (dissipador se não quente ou tóxico) e certifique-se que está já não quente e remove então a membrana.
  9. Lave no abanador com o 0.2XSSPE com 0.1% SDS no RT por 15 Min.
  10. Areje seco
  11. Exposição

 

Pontas para o borrão do norte

Se você tem atualmente um método preferido para isolar o RNA, continue a usá-lo.

Funcione sempre um gel do agarose de seu RNA para avaliar a qualidade. Confie não somente em resultados da espectrofotometria.

* Use a água tratada DEPC e produtos vidreiros cozidos. Esta solução, absolutamente, positivamente deve ser Rnase livre. O Rnase está em toda parte! Desgaste luvas, produtos vidreiros cozidos do uso somente, ou o plástico virgem. Deleite de DePC sua água, amortecedores (exceto Tris). Seja muito cuidadoso.

 

Borrões do norte de pesquisa de defeitos

Se você tem atualmente um método preferido para isolar o RNA, continue a usá-lo.

 

Discuta e afixe perguntas sobre isto no fórum do norte do borrão.

Referências do norte do borrão

  1. Alwine JC, Kemp DJ, GR austero (1977). O “método para a deteção de RNAs específico no agarose coagula-se por transferência ao diazobenzyloxymethyl-papel e a hibridação com ADN sonda”. Proc. Nacional. Acad. Sci. EUA 74 (12): 5350-4.
  2. W. Neal Burnette (abril 1981). ““Mancha ocidental”: transferência electrophoretic das proteínas do sulfato dodecyl de sódio - geles de polyacrylamide a nitrocelulose unmodified e deteção radiográfica com anticorpo e proteína radioiodinated A”. Biochem anal 112 (2): 195-203.