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Borrão Do norte

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AUDIO Escute uma explanação do norte detalhada do borrão!

History de borrar do norte

Borrar do norte é uma técnica borrando do RNA que seja desenvolvida em 1977 por Alwine et por al. na universidade de stanford (ref:1). Foi nomeado após a técnica do sul do borrão que borra para o DNA, inventada por Edwin M. Do sul em 1975. O borrão ocidental, um método para borrar para proteínas é também um jogo no borrão do sul que nomeia e foi nomeado em 1981 (ref:2).

Informação De Fundo - Técnica Do norte Do Borrão

A análise do norte apesar de sua idade no mundo do tech elevado do tempo real PCR, dos assays da proteção do nuclease (RPAs) e dos microarrays, é ainda a ouro-padrão para a deteção e o quantitation de níveis do mRNA. Isto é porque a análise do norte do borrão permite uma comparação direta da abundância do RNA do mensageiro entre amostras em uma única membrana.

No borrão do norte a diferença principal entre as outras técnicas borrando é que o RNA é o fator que está sendo detectado. Também, devido ao fato que o RNA único-está encalhado geralmente, cría as estruturas secundárias complexas que afetam sua migração e daqui desnaturando circunstâncias são usados funcionar os gels (ao contrário de do sul).

O RNA é separado para fora pelo electrophoresis do gel de RNA (geralmente electrophoresis do gel do agarose), por transferência subseqüente à membrana, pelo hybridization com ponta de prova, e finalmente pela deteção.

 

 

Similarmente a borrar do sul, as pontas de prova do hybridization podem ser DNA ou RNA em borrar do norte.

Um variant do procedimento sabido como o borrão do norte reverso ocasionalmente (embora, infrequëntemente) foi usado. Neste procedimento, a carcaça que o ácido nucleic (que affixed à membrana) é uma coleção de fragmentos isolados do DNA, e a ponta de prova é RNA extraído de um tecido e etiquetado radioativa.

O uso dos microarrays do DNA que vieram em uso difundido nos 1990s atrasados e no 2000s adiantado é mais akin ao procedimento reverso, que envolvem o uso dos fragmentos isolados do DNA affixed a uma carcaça, e ao hybridization com uma ponta de prova feita do RNA celular. Assim o procedimento reverso, embora originalmente uncommon, permitido o estudo do um-em-um-tempo da expressão do gene usando a análise do norte evoluir na expressão do gene que perfila, em que muitos (possivelmente tudo) dos genes em um organismo podem ter sua expressão monitorada

Aplicações do borrão do norte

Os borrões do norte foram superceded em a maioria de áreas por Real Tempo PCR e aproximações microarray. Não é usado frequentemente para finalidades clínicas ou diagnósticas.

O protocolo do norte do borrão e suas variações são usados entretanto na pesquisa molecular da biologia:

• um ouro-padrão para o estudo direto da expressão do gene no nível do mRNA (transcripts do RNA do mensageiro).
• deteção do tamanho do transcript do mRNA
• degradação do RNA do estudo
• emendar do RNA do estudo - pode detectar transcripts alternativamente emendados
• estude o half-life do RNA
• estudo IRES (local ribosomal interno da entrada) - para remover a possibilidade de digestão do RNA contra a à tradução do cistron.
• usou-se frequentemente confirmar e verificar ratos transgenic/knockout (animais)

Desvantagens de borrar do norte

As desvantagens de usar borrar do norte incluem:

• O radioactivity é usado frequentemente. Isto impede a facilidade de executar a, o uso e a eliminação. Os métodos novos da deteção non-radioactive foram gerados permitindo a deteção non-radioactive. Veja Para perfurar.
• O processo inteiro de borrar do norte faz exame de um tempo longo geralmente, da preparação da amostra completamente à deteção.
• Se as amostras do RNA forem uniformes degradadas ligeiramente por RNases, a qualidade dos dados e do quantitation da expressão é completamente negativamente afetada.
• O método do norte padrão do borrão é relativamente mais menos sensível do que assays da proteção do nuclease e RT-PCR. A sensibilidade de borrões do norte pode ser aumentada com o uso das membranas positivo-carregadas de nylon, uso de uma ponta de prova altamente específica do antisense.
• A deteção com pontas de prova múltiplas é um problema. Frequentemente, as membranas devem ser descascadas antes do hybridization e da deteção com uma segunda ponta de prova. Este é um problema porque as circunstâncias ásperas são requeridas para descascar pontas de prova do borrão e são também consumir do tempo. Também, há um limite à quantidade de épocas que um borrão pode ser descascado.

Vantagens de borrar do norte

As vantagens de borrões do norte incluem:

• É um método extensamente aceitado e bem considerado
• borrar do norte é um método straight-forward
• É usado frequentemente como uma confirmação ou uma verificação
• Frequentemente um ouro-padrão
• é um protocolo versátil porque pode permitir o uso de muitos tipos de incluir das pontas de prova (contra o tempo real PCR): radiolabeled e non-non-radiolabeled, em vitro transcreveu o RNA e mesmo os oligonucleotides tais como primers.
• As seqüências com mesmo homology parcial, ao contrário do tempo real PCR ou dos outros métodos podem ser usadas como pontas de prova do hybridization (isto é a seqüência da espécie diferente para a análise do homology, ou mesmo fragmentos genomic pode ser usada).

Protocolo Do norte Do Borrão

Como mencionado as etapas em borrar do norte incluem:

1. Isolação do RNA
2. Electrophoresis do gel do RNA para a separação
3. Transferência à membrana (o nylon geralmente positivamente carregado como o RNA é carregado negativamente)
4. Cross-linking do RNA à membrana (geralmente por meios UV-uV-crosslinking ou de produto químico)
5. Hybridization
6. Deteção

Os materiais necessitaram para o protocolo do norte do borrão

Receitas Do Amortecedor

20XSSPE (500 ml)

• NaCl de 3.6M: 105.2 g
• 0. amortecedor de phosphate pH de 2M 7.0: 100mL do 1M
• EDTA de 20mM: 20mL de 0.5M

Amortecedor de phosphate pH7.0 (500ml)

• NaH2PO4 140 mL (monobasic) do 1M
• Na2H2PO4 360 mL (dibasic) do 1M
• o pH a 7.0 após ambos é adicionado

Amortecedor do hybridization = HB (100mls)

• 5X SSPE: 25mls 20X
• 2% SDS: 20 mls 10%

 

* * Direito antes de usar-se adicione o RNA desnaturado 1000ug do fermento 5000ug do DNA do rNAse livre CT (calor a 95o por 3 minutos a desnaturar)

 

LAVAGEM: 2X SSPE + 0.1% SDS (500 mls) 50 mls dos mls 20X 5 10% SDS = 0.1% SDS

Amortecedor running para o gel do RNA (1L)

• 100 MOPS dos mls 10X
• 52. 6 mls do formaldehyde
• 847. 4 mls H20

Gel do RNA (70ml)

• 0.84 agarose de g
• 7 MOPS dos mls 10x
• 58.38 mls H2O
• Ponha o gel na solução pelo heating. Deixe o gel fresco a 60°C, adicione então o formaldehyde ao igual 0.66M -- 3.78 mls
• Derrame o gel na capa das emanações se possível

Amostras do RNA para o borrão do norte

Veja a isolação e o purification do RNA

Gel do RNA

Após ter isolado o RNA, o RNA deve ser separado para fora em um gel (geralmente agarose).

veja gels do RNA

Transferência do norte do borrão ao protocolo de nylon da membrana

Após ter funcionado o gel do RNA, lave o gel com água destilada posta sobre o posiblotter.

As camadas do alto ao fundo são:

• esponja
• 3-4 corte dos papéis de Whatman ao tamanho (ambos o estes acima acima devem ser embebidos em 10X SSPE mas não gotejar)
• máscara do gel.
• Nota: Certificam-se as folhas de prova do gel a máscara de modo que possa selar a membrana com linha do alto do gel e o canto superior direito marque 3 partes de um plástico duro 3M de papel ligeiramente mais grande com furos

A braçadeira sobre e certifica-se que há um selo bom. Use 75-80 milímetros hectograma da pressão para 1 hora ou mais.

Borre a membrana seca

Membranas De nylon Do Cross-linking - Protocolo Do norte Do Borrão

• Corte o envoltório superior do canto direito no envoltório de saran.
• UV irradiate com lado do RNA para baixo por 2.5 minutos.
• Lave para um par dos minutos na solução quente (solução de 2X SSPE/0.1% SDS da microonda por 30-45 segundos na potência de 50%.
• Areje seco

Pre hybridization para o borrão do norte

1. Hybridize pre por 6 horas-durante a noite
2. Ajuste o forno 65°C ao amortecedor do calor HB para pôr o SDS na solução
3. Role acima a membrana dentro da parte de engranzamento e ponha-a no hybridizaton tube(2X SSPE/0.1%SDS)
4. Verifique para ver se há bolhas de ar
5. Ponha o tubo no forno balançado com um outro tubo sobre o lado oposto

Ponta de prova etiquetando para borrar do norte

1. Ponha 25ng da ponta de prova em um volume total de 11uL com ddH2O
2. Desnature @ 95°C 3 minutos. Este é começar à ponta de prova único encalhado e remover a estrutura secundária que impediria o hybridization eficiente.
3. Esfrie rapidamente no gelo molhado. Este é manter único encalhado da ponta de prova, livre da estrutura secundária e não o reservar reannealing (ou reformar de estruturas secundárias).
4. Adicione total radiolabeled (Boehringer Mannheim) 5ul do alfa 4ul altamente principal P-32 dCTP 3000uCi/mmole 20ul
5. Incubate 10-15 37°C mínimos
6. Adicione 28uL do 1X TE, EDTA de 2ul 0.5M, à reação 20ul.
7. Pre-gire a coluna de G-25 Sephadex para 1 minuto.
8. Adicione a amostra 50ul à coluna e gire-a por 2.5 minutos no centrifugador clínico. Este é purify a ponta de prova away da etiqueta.
9. Do throw coluna afastado.
10. Misture em um RNA novo do fermento do tubo 100ug CT-DNA 50ug em um tubo 0.5mL.
11. Desnature 95° 3 minutos
12. Adicione à mistura hybrid do tubo, hybridize em 65°C por 20-36 horas

Afixe o protocolo do hybridization para borrar do norte

Hybridize por 36-48 horas lavam-se então.

1. Aqueça acima do calor de 2X SSPE/0.1% SDS (lavagem) até 65° C (banho da microonda ou da água do uso para aquecer a solução)
2. Remova o tubo e derrame o líquido no recipiente waste radioativo quente.
3. A enxaguadura com lavagem 10ml faz esta duas vezes e derrama o desperdício para fora.
4. Posto em 40 a 50 mls da lavagem e da agitação vigoursly.
5. Posto no forno do hybridization para girar 20 mínimo.
6. Derrame abaixo o dissipador
7. Um outro 40-50mls e agitação no forno.
8. Derrame para fora ao recipiente waste (dissipador if.not quente ou tóxico) e certifique-se que está um quente não mais longo e remove então a membrana.
9. Lave no shaker com o 0.2XSSPE com 0.1% SDS no RT por 15 minutos.
10. Areje seco
11. Exposição

 

Pontas para o borrão do norte

Se você tiver atualmente um método preferido para isolar o RNA, continue a usá-lo.

Funcione sempre um gel do agarose de seu RNA para avaliar a qualidade. Confie não somente em resultados do spectrophotometry.

* Use a água tratada DEPC e o glassware cozido. Esta solução, absolutamente, positivamente deve ser rnase livre. O rnase está em toda parte! Desgaste luvas, o glassware cozido do uso somente, ou o plástico virgem. Deleite de DePC sua água, amortecedores (exceto Tris). Tenha muito cuidado.

 

Borrões Do norte De Pesquisa de defeitos

Se você tiver atualmente um método preferido para isolar o RNA, continue a usá-lo.

 

Discuta e afixe perguntas sobre isto no forum do norte do borrão.

Referências Do norte Do Borrão

1. Alwine JC, Kemp DJ, GR Stark (1977). o "método para a deteção de RNAs específico no agarose gels por transferência ao diazobenzyloxymethyl-papel e o hybridization com DNA sonda". Proc. Natl. Acad. Sci. EUA. 74 (12): 5350-4.
2. W. Neal Burnette (Abril 1981). "' borrar ocidental ': transferência electrophoretic das proteínas dos gels de polyacrylamide do sulfate — dodecyl de sodium a nitrocellulose unmodified e da deteção radiographic com antibody e radioiodinated a proteína A ". Biochem Anal 112 (2): 195-203.