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O ÁUDIO
escuta uma explanação do norte detalhada do borrão!
A mancha do norte é uma técnica de mancha do RNA que seja desenvolvida em 1977 por Alwine e outros na Universidade de Stanford (referência: 1). Foi nomeada após a técnica do sul do borrão que borra para o ADN, inventada por Edwin M. do sul em 1975. O borrão ocidental, um método para borrar para proteínas é igualmente um jogo no borrão do sul que nomeia e foi nomeado em 1981 (referência: 2).
A análise do norte apesar de sua idade no mundo alta tecnologia do PCR do tempo real, dos ensaios da proteção da nuclease (RPAs) e dos microarrays, é ainda a ouro-padrão para a deteção e a quantificação de níveis do mRNA. Isto é porque a análise do norte do borrão permite uma comparação direta da abundância do RNA de mensageiro entre amostras em uma única membrana.
No borrão do norte a diferença principal entre as outras técnicas de mancha é que o RNA é o fator que está sendo detectado. Também, devido ao fato de que o RNA é geralmente single-stranded, cria as estruturas secundárias complexas que afetam sua migração e daqui desnaturando circunstâncias são usados para funcionar os geles (ao contrário de do sul).
O RNA é separado para fora pela electroforese do gel de RNA (geralmente electroforese do gel do agarose), por transferência subseqüente à membrana, pela hibridação com ponta de prova, e finalmente pela deteção.
Similarmente à mancha do sul, as pontas de prova da hibridação podem ser ADN ou RNA na mancha do norte.
Uma variação do procedimento conhecido como o borrão do norte reverso ocasionalmente (embora, infrequëntemente) foi usada. Neste procedimento, a carcaça que o ácido nucleico (de que é afixado à membrana) é uma coleção de fragmentos isolados do ADN, e a ponta de prova é RNA extraído de um tecido e etiquetado radioativa.
O uso dos microarrays do ADN que entraram uso difundido no final dos anos 90 e no 2000s adiantado é mais aparentado ao procedimento reverso, que envolvem o uso dos fragmentos isolados do ADN afixados a uma carcaça, e à hibridação com uma ponta de prova feita do RNA celular. Assim o procedimento reverso, embora original raro, permitido o estudo do um-em-um-tempo da expressão de gene usando a análise do norte para evoluir na expressão de gene que perfila, em que muitos (possivelmente tudo) dos genes em um organismo podem ter sua expressão monitorada
Os borrões do norte foram substituídos em a maioria de áreas por Tempo real PCR e por aproximações do microarray. Não é usado frequentemente para finalidades clínicas ou diagnósticas.
O protocolo do norte do borrão e suas variações são usados entretanto na pesquisa da biologia molecular:
As desvantagens de usar a mancha do norte incluem:
As vantagens de borrões do norte incluem:
Como mencionado as etapas na mancha do norte incluem:
* o *Right antes de usar adiciona o RNA desnaturado 1000ug do fermento 5000ug do ADN do CT do RNAse livre (calor a 95o para que o minuto 3 desnature)
LAVAGEM: 2X SSPE + 0.1% SDS (500 mls) 50 mls dos mls 20X 5 10% SDS= 0.1% SDS
Veja a isolação e a purificação do RNA
Após ter isolado o RNA, o RNA deve ser separado para fora em um gel (geralmente agarose).
veja geles do RNA
Após ter funcionado o gel do RNA, lave o gel com a água destilada põr sobre o posiblotter.
As camadas de de cima para baixo são:
A braçadeira sobre e certifica-se que há um bom selo. Use 75-80 milímetros hectograma da pressão para 1 hora ou mais.
Borre a membrana seca
Cruze por 36-48 horas então de Washington.
Se você tem atualmente um método preferido para isolar o RNA, continue a usá-lo.
Funcione sempre um gel do agarose de seu RNA para avaliar a qualidade. Confie não somente em resultados da espectrofotometria.
* Use a água tratada DEPC e produtos vidreiros cozidos. Esta solução, absolutamente, positivamente deve ser Rnase livre. O Rnase está em toda parte! Desgaste luvas, produtos vidreiros cozidos do uso somente, ou o plástico virgem. Deleite de DePC sua água, amortecedores (exceto Tris). Seja muito cuidadoso.
Se você tem atualmente um método preferido para isolar o RNA, continue a usá-lo.
Discuta e afixe perguntas sobre isto no fórum do norte do borrão.
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