PCR do tempo real

O PCR do tempo real é um tipo de PCR quantitativo que mede a quantidade de cDNA ou de mRNA em uma amostra, de uma população das pilhas (cultura do tecido ou de pilha), ou recentemente mesmo de uma única pilha. O tempo real é usado geralmente determinar a expressão do mRNA de um gene, e sua expressão nivela (número de cópia de mRNA) durante determinadas condições (tais como o tratamento de pilhas com uma droga).  O PCR do tempo real pode ser usado para comparar amostras normais (do controle) às amostras da doença, dando uma idéia a respeito das mudanças da expressão que ocorrem com patogénese.  O PCR do tempo real devido a sua sensibilidade é usado igualmente na deteção dos micróbios patogénicos no sangue tal como vírus.

O desenvolvimento do PCR quantitativo tempo real eliminou a variabilidade associada tradicional com o PCR quantitativo, assim reservar
quantificação rotineira e de confiança de produtos do PCR.

Índice

Cada tipo expressess da pilha um jogo de moléculas do mRNA, conhecido como um transcriptome.  Em resposta aos estímulos, as pilhas podem acima-regular ou para baixo-regular fatores tais como enzimas da proteína dentro da pilha regulando os níveis do mRNA destes fatores.  os níveis do mRNA não são correlacionados sempre com os níveis da proteína assim que algum cuidado é necessário, porém geralmente os níveis do mRNA correspondem frouxamente aos níveis da proteína.  Medir os níveis do mRNA de determinados fatores dentro de uma pilha que usa o pcr do tempo real é um método que dê indícios a respeito das quantidades destas fatores ou proteínas.

Tradicional, os níveis do mRNA dentro da pilha foram medidos usando a mancha do norte.  Esta técnica está considerada como um ouro-padrão na medida de níveis da expressão de gene/mRNA enquanto usa ponta de prova radiolabeled para etiquetar o RNA, que está determinado então usando um contador de scintillation que dá leituras muito exatas. A mancha do norte embora muito exato teve diversas desvantagens incluir o uso da radioactividade. A mancha do norte exigiu a medida exata do mRNA e o RNA total das pilhas extraiu a fim comparar amostras. Este era um problema porque embora os métodos de deteção fossem muito exatos, o erro poderia ser introduzido na mancha do norte (ou no ponto do RNA/entalhe que borra) com as diferenças em níveis totais de RNA/mRNA entre as amostras (tratamentos da pilha do IE, tecidos diferentes, animais diferentes, etc.).  Igualmente exigiu relativamente as grandes quantidades de RNA que exigiram um grande número pilhas. Recentemente, a quantificação do gene do mRNA ou os métodos tempos real do pcr foram melhorados e são mais fácil de executar e não exigem o uso da radioactividade.  Os investigadores têm frequentemente somente o acesso às pequenas quantidades de pilhas especial no campos da pesquisa da pilha de haste e da pesquisa da pilha preliminar, e o pcr do tempo real tornou possível determinar muito níveis do mRNA mesmo de um pequeno número de pilhas e ultimamente mesmo das únicas pilhas.  Entretanto, esta sensibilidade extrema de métodos tempos real do pcr faz vital proteger suas amostras da contaminação, que conduziria aos resultados falsos. Os métodos atuais e os sistemas do pcr do tempo real igualmente não exigem a medida do mRNA ou as concentrações da amostra do cDNA antes do pcr do tempo real são conduzidas.

Higuchi e al.1, 2 abriram caminho a análise da cinética do PCR construindo um sistema que detectasse produtos do PCR como
acumulam. Este sistema “tempo real” inclui o brometo de ethidium do intercalator em cada reação da amplificação,
um cycler térmico adaptado para irradiar as amostras com luz ultravioleta, e deteção da fluorescência resultante
com uma câmera de refrigeração controlada por computador do CCD. A amplificação produz quantidades crescentes de double-stranded
ADN, que liga o brometo de ethidium, tendo por resultado um aumento na fluorescência. Traçando o aumento na fluorescência
contra o número de ciclo, o sistema produz os lotes da amplificação que fornecem um retrato mais completo do
O PCR processa do que a acumulação de análise do produto após um número fixo de ciclos.