Protocolos estáveis do Transfection

O AfCS está utilizando a tecnologia antisentido para manipular a expressão da proteína da sinalização nos 264.7 CRUS macrófago-como a linha celular. Isto pode ser conseguido pelo transfection de oligonucleotides antisentido gene-específicos (ASOs). O seguinte procedimento envolve o transfection de ASOs em 264.7 pilhas CRUAS usando o reagente do transfection de FuGENE 6. Subseqüentemente, o RNA ou a proteína total isolada destas pilhas transfected podem ser usados para avaliar o nível de knockdown do mRNA ou da proteína, respectivamente. - [Transfection antisentido lido do Oligonucleotide de 264.7 pilhas CRUAS com FuGENE 6 em um prato 24-Well]

Os campos elétricos pulsados podem ser usados para introduzir o ADN em uma grande variedade das pilhas animais. O Electroporation trabalha bem com linha celular que são refractive a outras técnicas, tais como o coprecipitation de fosfato-ADN do cálcio. Mas, como com outros métodos do transfection, as condições óptimas para electroporating o ADN em linha celular não experimentadas devem ser determinadas experimental. - [Transfection lido do ADN por Electroporation]

As pilhas de CHO Lec 3.2.8.1 têm 4 mutações independentes caminhos no glycosylation de N e de O. Quando cultivado com alfa-glucosidase eu inibidor N-butílico-deoxynojirimycin, glicoproteína produzi em pilhas de CHO Lec 3.2.8.1 sou completamente suscetível à digestão Endo de H. H Endo fende o chitobiose, deixando um único N-acetylglucosamine N-lig por o local que é ideal para a manutenção do solubility de proteína e de interações especiais da carburador-proteína, como entre o primeiros resíduo e tryp da glucosamina do N-acetyl. - [Estabelecimento lido de Transfectant estável do protocolo das pilhas de CHO Lec]

As pilhas estàvel transfected, geradas nos primeiros dois estágios do procedimento, são induzidas para a expressão do gene do alvo. Após a colheita e o lysis, os lysates são analisados SDS-PAGE e immunoblotting. - [Tetracycline lido como o regulador da expressão de gene Inducible III]

O protocolo usa um sistema autoregulatory em que o tTA transcriptional do transporte-activador conduz sua própria expressão e aquela de um gene do alvo. A primeira fase do procedimento descreve como gerar linhas estáveis de pilhas NIH-3T3 que expressam o tTA sozinho ou o tTA e o gene tetracycline-regulado do alvo. - [Tetracycline lido como o regulador do protocolo Inducible da expressão de gene]

Este estágio do procedimento descreve o transfection com os genes do alvo das linha celular já que expressam o tTA inducible. Neste exemplo, os genes do alvo transfected em um plasmídeo que carreg a resistência do puromycin como um marcador selecionável. - [Tetracycline lido como o regulador do protocolo Inducible II da expressão de gene]