Protocolos da imagem latente da Viver-Pilha

Este protocolo descreve uma preparação selada que permita a observação a longo prazo contínua de pilhas mamíferas cultivadas na verticalidade ou de microscópios invertidos sem controle ambiental do CO2. A preparação permite as circunstâncias óticas consistentes com a imagem latente de alta qualidade e a boa viabilidade da pilha no mínimo 100 horas. - [Lido uma preparação selada para observações a longo prazo de pilhas cultivadas]

Protocolo nos detalhes exigidos da construção da corrediça da sustentação para uma preparação selada para observações a longo prazo de pilhas cultivadas. - [Lido uma preparação selada para observações a longo prazo de pilhas cultivadas: Construção da corrediça da sustentação]

A medida e a manipulação manuais da superfície da pilha exigem o acesso às pilhas, geralmente em uma câmara aberta. As câmaras ou as inserções Temperature-controlled do estágio são preferidas mantendo a atividade physiological durante a experiência. Por exemplo, os pratos de cultura heated com partes inferiores de vidro da lamela (Bioptechs) permitem a microscopia de fluorescência high-resolution de pilhas vivas durante a aplicação da força. - [Câmaras lidas para a examinação de pilhas vivas sob o protocolo mecânico do esforço]

As câmaras do espécime tiveram muitos projetos publicados sobre os anos que descrevem os sistemas que oferecem propriedades óticas excelentes ao permitir que os espécimes sejam mantidos para quantidades de tempo de variação. Variar na complexidade da preparação simples de uma lamela selada em uma corrediça do microscópio às câmaras sofisticadas da perfusão que permitem o controle apertado de virtualmente todas as câmaras da cultura das variáveis ambientais é projetado a permitir que os espécimes de vida sejam observados com invasão mínima no res elevado. - [Câmaras lidas da cultura para a imagem latente da Viver-Pilha]

Ao escolher uma molécula particular para o photoactivation estuda, é necessário ter algum conhecimento estrutural da molécula a fim projetar uma espécie apropriadamente prendida que retenha sua inactividade biológica até que uncaging esteja efetuado. Inclui a síntese de peptides ou de proteínas prendidas. - [Projeto, síntese, e caracterização lidos de compostos prendidos]

Usando proteínas confocal do microscópio da laser-exploração & da fusão de GFP na imagem latente do tempo-lapso para visualizar o comportamento dos organelles e para segui-lo membrana-limite os intermediários do transporte que brotam fora dos organelles. As edições práticas relativas à construção & à expressão de proteínas da fusão de GFP são discutidas. Essencial para aperfeiçoar os níveis do brilho e da expressão de proteínas da fusão de GFP de modo que intracellular membrana-limite as estruturas que contêm estas proteínas da fusão pode prontamente ser visualizado. - [Imagem latente lida de sistemas da membrana do Organelle e de tráfego da membrana em pilhas vivas]

as técnicas de imagem latente da Viver-pilha fornecem a introspecção crítica na natureza fundamental da função celular & do tecido, especial devido aos avanços rápidos que estão sendo testemunhados atualmente na proteína fluorescente & na tecnologia fluorófora sintética. Por causa destes avanços, a imagem latente da viver-pilha transformou-se uma ferramenta analítica necessária em a maioria de laboratórios de biologia da pilha. Inclui: Pilhas vivas de manutenção no estágio de microscópio; Câmaras da cultura da imagem latente da Viver-Pilha; Exigências etc. do sistema óptico e do detetor - [introdução lida às técnicas de imagem latente da Viver-Pilha]

Este protocolo descreve um método para avaliar concentrações de cálcio cytoplasmic livre, [Ca2+] i, para 264.7 pilhas CRUAS aderentes cultivadas coverglass em 8 de um poço. Este objetivo é realizado usando a tintura fluorescente de Ca2+-sensitive, o acetoxymethyl fura-2 (AM), que permeates as membranas de pilha como um éster e hydrolyzed na pilha a seu formulário ácido de Ca2+-sensitive. A fluorescência para as pilhas aderentes é medida sobre o tempo com pilhas que foram lavadas livre da tintura extracellular. - [Medidas Fura-2 Single-Cell vivas lidas para determinar o cálcio livre Intracellular]

GFP sere como um marcador molecular que possa ser imaged dinâmicamente em pilhas vivas, em seu formulário nativo & como uma fusão a outras proteínas. Para a imagem latente de GFP, as plantas apresentam o desafio do autofluorescence da clorofila, das divisões celulares lignified, dos índices vacuolar, e dos outros materiais da pilha, que podem obscurecer o sinal de GFP. Maximizar a relação signal-to-noise é um interesse principal, e a reflexão prudente deve ser dada à escolha do tecido imaged, da expressão de GFP nível, etc. - [imagem latente lida da Viver-Pilha de GFP nas plantas]

as técnicas de imagem latente da Viver-pilha fornecem uma introspecção crítica na natureza fundamental da função celular e do tecido, especial devido aos avanços rápidos que estão sendo testemunhados atualmente na proteína fluorescente e na tecnologia fluorófora sintética. Por causa destes avanços, a imagem latente da viver-pilha transformou-se uma ferramenta analítica necessária em a maioria de laboratórios de biologia da pilha. - [Pilhas vivas de manutenção lidas no estágio de microscópio]

Diversas drogas comuns, seus alvos, e os protocolos são descritos estudando a distribuição do organelle e traficando. As drogas estão prontamente - disponíveis dos fornecedores gerais, incluindo o Sigma, o Roche, e o Calbiochem. - [Tráfico lido da membrana e reagentes do Organelle]

Este protocolo descreve um método para observar e medir o movimento de moléculas do RNA no núcleo de pilhas mamíferas de vida. Os oligonucleotides fluoresceína-etiquetados prendidos do ADN são introduzidos nas pilhas mamíferas de vida, onde cruzam demonstrably ao RNA complementar. Após o photoactivation local-específico em locais desejados dentro da pilha, os movimentos do RNA longe daqueles locais são seguidos e gravados digital usando um sistema rápido da microscopia da aquisição. - [Rotulagem e in vivo seguimento Photoactivation-Baseados lidos de moléculas do RNA no núcleo]