Electrotransformation de BMH 81-17mut S para isolar mutantes Local-Dirigidos do dsDNA

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Electrotransformation de BMH 81-17mut S para isolar mutantes Local-Dirigidos do dsDNA

Data adicionada: 05:54 maio de 27, 2008: 46 AM

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Categoria: Protocolos da transformação das bactérias

A pilha de Transfected ES da colheita clona o protocolo

Clone da pilha de Transfected ES da colheita - dia 14

1. Aproximação amigável as pilhas electrocompetent no gelo.

2. Refrigere as cubetas e os tubos do microcentrifuge que contêm o ADN.

3. Em um tubo de centrifugador estéril de 15 ml, misture 1 ml da solução do Electroporation da libra.

4. Verific a instalação do equipamento do electroporation. Certifique-se que o controlador do pulso está obstruído dentro e ajustado em 400. Ajuste a capacidade em 25 que o F. ajustou a tensão em 2.5 quilovolts (máximo).

5. Imediatamente antes do electroporation de cada amostra, encha um Pasteur introduzem com pipeta e bulbo com o 1 ml da mistura da libra no tubo de 15 ml.

6. Tome as pilhas acima em uns 200 litros ponta, misture-as com o ADN e a transferência à cubeta esvaziando a ponta abaixo de um lado da cubeta. (Sugestão #1).

7. Limpe fora toda a umidade nos lados da cubeta.

8. Coloc a cubeta no suporte da cubeta e pressione ambas as teclas vermelhas simultaneamente até que o sinalizador soe. (Sugestão #2).

9. Deixe as pilhas agitar em 255 RPM por 45 a 60 minutos em 37°C.

10. O depois de uso, enxágua imediatamente as cubetas completamente com álcool etílico de ddH2O e de 95%. Deixe o ar das cubetas seco.

11. Chapeie 10 litros da suspensão da pilha nas placas da libra que contêm o antibiótico apropriado para o plasmídeo. (Sugestão #3).

12. Adicione o descanso da suspensão de 1 ml a 5 ml da libra que contem o antibiótico apropriado. Adicione 2.5 ml a um tubo estéril, e o descanso a um outro tubo estéril.

13. Cresça as culturas durante a noite (12 a 16 horas) em 37°C em uma incubadora de agitação em 225 RPM.

14. Parte alíquota 1 ml por o tubo do microcentrifuge para um total de 4 tubos do microcentrifuge (veja a sugestão # 4).

15. Prepare o ADN do plasmídeo pelo procedimento do miniprep. (Veja o protocolo na preparação do ADN do plasmídeo). Resuspend o ADN do plasmídeo em um volume de 75 litros de TE.

16. Digira 1 litro do miniprep usando 40 unidades da enzima da limitação que representa o local original no plasmídeo original em um volume total de 40 L. (veja o protocolo na digestão da enzima da limitação).

17. Incube a reação da digestão por 2.5 a 4 horas.

18. Electrophorese 2 litros da mistura do sumário da limitação em um gel do agarose para certific da amostra pareça digerida inteiramente. (veja o protocolo para o ADN de Electrophoresing em um gel do Agarose).

19. Purify o ADN no descanso da mistura da reação (veja o protocolo na purificação do ADN do plasmídeo) (veja a sugestão #5).

20. Use 0.3 litros para a transformação nas pilhas DH5 (veja o protocolo na transformação). Chapeie 5 litros e 50 litros nas placas da libra que contêm o antibiótico apropriado.

21. Escolha colônias e isole o ADN do plasmídeo. (Veja o protocolo na isolação do ADN do plasmídeo).

22. Digira o ADN com uma enzima da limitação que não corte o plasmídeo recentemente transformado. (Veja o protocolo na digestão da enzima da limitação).

23. Arranje em seqüência aqueles clone que não são digeridos pela enzima específica da limitação cujo o local foi transformado (veja o protocolo em arranjar em seqüência o ADN). Estes são os clone que devem conter a mutação local-dirigida (sugestão #6).

Soluções e amortecedores

Pilhas electrocompetent do mut S das pilhas BMH 81-17 do mut S das pilhas BMH 81-17 do mut S de BMH 81-17

Veja o protocolo em fazer pilhas electrocompetent

Amortecedor 10 milímetro Tris de TE

pH 8.0

o EDTA de 1 milímetro

Placas da libra

Loja das placas da libra em 4°C até que necessário
Bacto-ágar de 15 g/liter
Deixe fresco a 50°C antes de adicionar algum antibiótico.
Prepare na libra
A garrafa do redemoinho e derrama a placa de aproximadamente 30 ml/petri (100 milímetros).
Deixe os media ajustados.
95% (v/v) álcool etílico
Sterilize esterilizando por 20 minutos em uma pressão de 15 libras/polegada quadrada no ciclo líquido.

Caldo de carne de Luria (libra) NaCl de 5 g/liter
extrato de fermento de 5 g/liter
Tryptone de 10 g/liter
1 ml/liter NaOH de 1 M

NaOH de 1 M

Solução do Electroporation da libra 1 ml do amortecedor da libra
10 milímetros de sulfato de magnésio
0.4% (w/v) glicose

Pilhas de DH5α

Pilhas electrocompetent das pilhas DH5α de DH5α
Veja o protocolo em fazer pilhas electrocompetent

BioReagents e produtos químicos:

O EDTA
Sulfato de magnésio
Tris
Hidróxido de sódio
Cloreto de sódio
Bacto-Ágar
Extrato de fermento
Tryptone
Antibiótico
Álcool etílico
Glicose

Pontas do protocolo:

1. Bata as pilhas para baixo à parte inferior da cubeta de modo que as pilhas dêem forma a uma camada uniforme de um lado ao outro. Tente evitar todas as grandes bolhas de ar.

2. A constante de tempo deve ser 7.0 a 7.5 milissegundos como menos de 6.5 milissegundos dão a viabilidade reduzida, menos de 4 dá uma explosão pequena, geralmente de uma concentração iónica demasiado elevada nas amostras. Se a constante de tempo é maior de 8, a eficiência do electroporation é baixa. Se qualqueras um circunstâncias resultam, tome uma cubeta, uma amostra, umas pilhas e uma tentativa frescas outra vez. Se não, verific a competência das pilhas e repurify o ADN.

3. Esta etapa é usada para verific a eficiência do electroporation. A freqüência do electroporation do ADN linear é sobre thousand-fold um menos eficiente do que o ADN circular do plasmídeo. Desde que uma parcela considerável do ADN será linear usando este protocolo, a eficiência total por o micrograma do ADN será menos do que a eficiência prevista usual.

4. Se você tem muitos mutantes diferentes, dois tubos do microcentrifuge por o clone do mutante bastarão.

5. Os contribuinte deste protocolo purify o ADN carregando o descanso da mistura do sumário da limitação em uma coluna do biogel P10™. Purify de acordo com recomendações do fabricante.

6. Para únicas mudanças baixas no ADN do alvo, geralmente 100% dos minipreps selecionados terão a seqüência transformada direita. Para umas mutações mais complicadas, esta freqüência varia 10 a 100%.

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