A pilha de Transfected ES da colheita clona o protocolo

A pilha de Transfected ES da colheita clona o protocolo

Clone da pilha de Transfected ES da colheita

A pilha de Transfected ES da colheita clona o dia 14

1. Comece este protocolo seis dias após electroporating as pilhas do ES (veja o protocolo no Electroporation de pilhas do ES).
2. Veja os 10 pratos do cm que contêm as pilhas transfected do ES através do microscópio invertido. Os clone são visíveis como ninhos pequenos de pilhas ràpida crescentes. Têm beiras apertadas e são embalados pròxima. As pilhas maiores dentro da colônia, com membranas bem definidas são as pilhas que estão começando a se diferenciar. Não escolha estes clone! Este é o dia 6 do processo de selecção. Se os clone são grandes bastante você pode escolher neste dia, ou em espera até o dia 7.
3. Para escolher os clone, setup um microscópio invertido em uma capa do fluxo laminar.
4. Prepare as 24 placas boas (feitas na seção D do protocolo no Electroporation de pilhas do ES) removendo os media velhos e substituindo com os media de uma seleção de 1.0 ml ES por o poço.
5. Coloc os cinco 24 pratos bons de novo na incubadora.
6. Substitua os media da seleção do ES no primeiro prato de 10 cm com os media frescos da seleção do ES.
7. Coloc o prato sob o microscópio e veja as pilhas na ampliação 4X e 10X. Tente ser certo identificar somente os clone que não começaram ainda se diferenciar (veja a sugestão #1). Isole o clone a ser escolhido no campo da visão.
8. Usando uma ponta da pipeta da barreira de 0 a 160 μl, empurre delicadamente o clone do ES para a frente do MEFs circunvizinho. Com o pipettor ajustado entre o μl 30 e 50, e a tecla do atuador já comprimida, arranque o clone usando um movimento de escavação para diante da sucção. Se o pipettor é ajustado no μl 30, deve haver bastante sucção para desalojar o clone da placa. Entretanto, se a camada inactivated do MEF é demasiado densa, pode ser difícil desalojar os clone do ES. Neste caso, arrelie com cuidado o MEFs circunvizinho longe do clone sem interromper o clone com a ponta do pipettor. Colha então os clone.
9. Coloc cada clone em um dos 24 poços que contêm media da seleção do ES.
10. Continue a escolher clone e lugar nos poços das 24 placas preparada do poço até que 12 clone estejam escolhidos ou o prato de 10 cm for fora da incubadora para o minuto 15 (veja a sugestão #2).
11. Coloc a placa que contem os clone escolhidos na incubadora.
12. Continue a escolher clone até que todos os 24 poços estejam preenchidos todos os pratos preparados (veja a sugestão #3).
13. Coloc os 24 pratos bons na incubadora durante a noite.
14. Veja o protocolo em Dissaggregation, em expansão, e na congelação de clone de Transfected ES.

BioReagents e produtos químicos:

• Ácidos aminados Non-Essential
• Media da águia modificada de Dulbecco (DMEM)
• HEPES
• G-418 (Geneticin)
• 2-Mercaptoethanol
• ESGRO (fator Inhibitory da leucemia Murine, LIF)
• L-Glutamina
• Soro Fetal da vitela (FCS), calor Inactivated

Pontas do protocolo:

1. Após o electroporation e a seleção subseqüente, é importante escolher com cuidado clone estáveis para uma expansão mais atrasada e uma análise do ADN. Clona (que contêm muitos ninhos pequenos das pilhas) deve aumentar no tamanho durante a seleção mas não se submeter à diferenciação. As pilhas empilharão acima e manterão uma colônia discreta sobre as pilhas de alimentador. As pilhas dentro de um clone aderirão firmemente a um outro, fazendo o difícil considerar pilhas individuais; uma beira apertada deve cercar o clone. Os clone do ES crescerão bem na camada do alimentador do MEF, dando forma a várias formas, tais como oblongo ou triangular. Os clone que exibem a heterogeneidade celular, tal como a formação endodermal da pilha na superfície livre da parte externa da colônia, ou um espalhamento das pilhas na periferia e aplainar geral, não devem ser selecionados.

2. Os clone são sensíveis às mudanças do pH e de temperatura.

3. Se você não podia escolher todos seus clone no dia 6 da seleção, você pode continuar a escolher no dia 7. da seleção. Os contribuinte deste protocolo não recomendam escolher clone no dia 8.