3' A amplificação rápida do cDNA termina a RAÇA usando o protocolo do PCR

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' a amplificação 3 rápida do cDNA termina a RAÇA usando o protocolo do PCR

A data adicionou: 10:26 abril de 11, 2008: 01 PM

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Primeiro protocolo da síntese do cDNA da costa

1. Dissolva o μg 1 a 5 o μg do RNA poli de (A)+ ou 10 a 20 do RNA total no μl 10 da água DEPC-tratada (veja a ponta #2).

2. Incube o RNA em 65°C por 5 Min.

3. Refrigere o RNA no gelo.

4. Adicione o seguinte ao RNA:
   μl 2 do amortecedor do PCR 10X
   μl 2 de dNTPs de 10 milímetros
   μl 2 de 10 milímetros DTT
   0.5 μl de RNasin
   μl 3 de 100 ng/ml (descolamento) 17-Adaptor
   1 μl de AMV Transcriptase reverso (veja a ponta #3)

5. Incube a reação em 42°C para 1 a 2 horas.

6. Incube a reação em 95°C para que o minuto 5 pare a reação.

7. Dilua a mistura de reação com o μl 180 de TE

Amplificação rápida (RAÇA) do protocolo do cDNA do alvo

1. Use 1 a 10 partes alíquota do μl da associação acima do cDNA e adicione o seguinte:

3. Combine 10 partes alíquota do μl dos produtos do PCR com as 5 partes alíquota do μl da tintura do carregamento da sacarina.

4. Carregue as amostras em um gel do Agarose para a análise dos produtos da reação (veja a ponta #6)

COMPITA amortecedores

_DEPC-ddH2O

_DEPC-ddH2O

_DEPC-ddH2O		Agite ou agite a solução Autoclave para que o minuto 15 inactivate o DEPC (CUIDADO! Veja a ponta 1) Igualmente veja a ponta 2 Permita que a solução sente no mínimo 12 horas

_DEPC-ddH2O		0.1% (v/v) pirocarbonato Diethyl (DEPC) em ddH2O

Adaptador		adaptador de 50 ng/μl 5 ' - CAT CG-3 DE GAC TCG AGT CGA

dNTPs de 10 milímetros		10 milímetros de dATP 10 milímetros de dTTP 10 milímetros de dGTP 10 milímetros de dCTP

primeira demão Gene-específica		primeira demão antisentido de 50 ng/μl ao gene do interesse

amortecedor do PCR 10X		15 milímetros de MgCl2 500 milímetros de KCl 100 milímetros de Tris-Cl, pH 8.3

_DEPC-ddH2O

(descolamento) 17-Adaptor		5 ' - CAT CGA TTT TTT TTT TTT TTT TT-3 DE GAC TCG AGT CGA 100 ng/μl (descolamento) 17-Adaptor

Tintura do carregamento da sacarina (6X)		0.25% (w/v) Xylene Cyanol 0.25% (w/v) azul do bromofenol 40% (w/v) sacarina

dNTPs de 2 milímetros		2 milímetros de dGTP 2 milímetros de dCTP 2 milímetros de dATP 2 milímetros de dTTP

10 milímetros DTT

Materiais para a RAÇA

AMV Transcriptase reverso
dCTP
RNasin
dTTP
dGTP
Sacarina
dATP
Cloreto do magnésio
Álcool Isoamyl
Clorofórmio
Fenol
Cloreto do potássio
Tris
Potássio Cacodylate
Pirocarbonato Diethyl (DEPC)
DTT
Cloreto do cobalto
(descolamento) 17-Adaptor
Polymerase de ADN, Taq
Azul do bromofenol
Oligonucleotide
Xylene Cyanol

Pontas do protocolo

1. CUIDADO! Esta substância é um biohazard. Consulte MSDS deste agente para instruções de manipulação apropriadas.

2. Para minimizar a degradação do RNA por RNases, desgaste luvas ao segurar amostras e reagentes, e luvas da mudança regularmente ao trabalhar. Trate a água e as soluções com o DEPC (pirocarbonato diethyl) para inactivate RNases, e use as soluções preparadas com água e equipamento RNase-livres.

3. AMV Transcriptase reverso é usado porque é mais estável em umas mais altas temperaturas do que outros transcriptases reversos. Isto permite a reação prosiguer em 55°C, se desejado assim, eliminar estruturas secundárias do RNA potencial inhibitory.

4. Não há nenhuma necessidade de purify o cDNA porque a atividade do RNase H do AMV Transcriptase reverso degrada o molde do RNA.

5. As condições do ciclo dependerão de sua primeira demão, do tamanho do produto do PCR, etc. aperfeiçoam o PCR para sua aplicação particular.

6. A análise do sul do borrão pode igualmente ser executada usando uma ponta de prova gene-específica interna.

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