Protocolo da ligadura do ADN

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Protocolo da ligadura do ADN

A data adicionou: 10:15 abril de 11, 2008: 50 PM

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Categoria: Protocolos do ADN: Clonagem do ADN

Protocolo da ligadura

1. Setup o DNAs adicionando o seguinte em um tubo do microcentrifuge:
   0.1 a 0.2 vetores preparados μg (veja a sugestão #1)
   1 - ao excesso do molar de 3 dobras de inserção preparada
   Adicione ddH2O para dar um volume final do μl 6.1
   Certifique-se setup um controle negativo que esteja faltando o ADN da inserção (veja a sugestão #2).

2. Aqueça o DNAs diluído a 68°C por 3 minutos (veja a sugestão #3).

3. Coloc imediatamente os tubos no gelo.

4. Prepare o cocktail da reação da ligadura adicionando o seguinte em ordem em um tubo do microcentrifuge no gelo:

   Adicione por a reação coesiva da ligadura do fim:
   1 μl do amortecedor da ligase 10X
   0.5 μl do ATP de 10 milímetros
   0.1 μl de 10 mg/ml BSA acetificado (NEB)
   0.3 μl de 1 ligase do ADN de Weiss Unit/μl T4 (USB) (veja a sugestão #4)

   - OU

   Adicione por a reação da ligadura do fim sem corte (veja a sugestão #5):
   1 μl do amortecedor da ligase 10X
   0.3 μl do ATP de 10 milímetros
   0.1 μl de 10 mg/ml BSA acetificado (NEB)
   μl 2 do PEG 8000 de 40% (veja a sugestão #6)
   0.3 μl 6.66 da ligase do ADN de Weiss Units/μl T4 (Nova Inglaterra Biolabs)

5. Adicione o cocktail preparado na etapa #4 ao DNAs no gelo.

6. Incube em 16°C para 1 hora.

7. Opcional: Se é possível, setup um sumário da limitação da mistura da ligadura usando uma enzima da limitação que os cortes dentro do vetor começando mas não cortem o produto ligado. Isto selecionará de encontro aos non-recombinants (veja a sugestão #7).

8. Transforme Escherichia Coli competente com 0.5 μl ao μl 2 da mistura da ligadura (veja o protocolo ID#568).

Amortecedores da ligadura

Amortecedor da ligase (10X)		Tris-HCl de 660 milímetros, pH 7.6 Faça fresco cada semana 2 a 3 66 milímetros de MgCl2 100 milímetros DTT

10 mg/ml BSA acetificado

PEG 8000 de 40%		40% (w/v) glicol de polietileno MW = 8.000

Materiais necessários para a ligadura

Tris
Ligase do ADN, T4
DTT
BSA acetificado
Oligonucleotide
Glicol de polietileno (PEG) 8.000
ATP
Cloreto do magnésio

1. Antes da ligadura, o fragmento do vetor é tratado frequentemente com a fosfatase alcalina para remover os 5 ' resíduos do fosfato a fim impedir a auto-ligadura do vetor. Isto é particular importante de fazer se o vetor foi cortado somente uma vez, deixando extremidades compatíveis.

2. Além, um controle negativo que esteja faltando o ADN do vetor é útil nos casos onde as inserções puderam ser contaminadas com os fragmentos do vetor.

3. Isto derrete todas as extremidades pegajosas que puderem ter recozido.

4. Uma unidade de Weiss é a quantidade de enzima de que catalisa a troca de 1 nmole [^32P] do pirofosfato no γ, β- [^32P] - ATP no minuto 20 em 37°C.

5. Para ligadura da sem corte-extremidade, ajuda provavelmente a usar mais ligase e menos ATP do que ligadura coesivas ou “pegajosas” do fim, como indicado.

6. O PEG inibe a transformação; reduzi-lo ao μl 1.0 por a ligadura pode ter resultados semelhantes.

7. Isto é sabido como do “um corte assassino.” A base racional para cortes do assassino é que toda a contaminação com vetor começando religated ou vetor começando intato estará tornada linear e assim transformará as bactérias muito menos eficientemente do que o produto intermolecular circular da ligadura. Por exemplo, se um BGL Ii-digeriu a inserção é clonada em um local de BamHI em um vetor e a inserção própria não contem nenhuma locais de BamHI, a seguir depois da ligadura, BamHI pode ser usado para tornar linear todo o vetor que religated sem inserção. Aqueles fragmentos do vetor que ligaram com inserção perderam o local de BamHI e são protegidos agora da atividade de enzima da limitação.

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