In vitro protocolo traduzido do ensaio da quinase do MOS do Xenopus

In vitro protocolo traduzido do ensaio da quinase do MOS do Xenopus

In vitro protocolo da tradução da quinase do MOS do Xenopus

•  Traduza o MOS etiquetado em um extrato do CSF (veja o protocolo na preparação do extrato do CSF e veja a ponta #1).

Anticorpo ao emperramento do antígeno

1. Dilua o extrato pelo menos quíntuplo no amortecedor da quinase H1.
2. Adicione uma suficiente quantidade de anticorpo que reconhece o Tag usado em construir a proteína etiquetada do MOS (veja Tip#2).
3. Incube no gelo para 1 hora (veja Tip#3).

Proteína um protocolo obrigatório do anticorpo do Sepharose

1. Equilibre a proteína grânulos do Sepharose um 6MB (Pharmacia) com amortecedor da quinase H1 suspendendo os grânulos no amortecedor (veja a ponta #4).
2.  Centrifugue para o segundo 30 ou o menos em um microcentrifuge para granular os grânulos.
3. Remova o supernatant e repita as etapas #C1 e #C2 duas mais vezes.
4.  Resuspend os grânulos no amortecedor da quinase H1 para dar uma pasta de 50% dos grânulos.
5. Para determinar quanto proteína um Sepharose a se usar, considera quantas reações da quinase serão realizadas com cada immunoprecipitate. É importante que cada um dos tubos da reação da quinase recebe o μl aproximadamente 10 de grânulos embalados. Assim, se uma imunoprecipitação é ser maneiras da separação 4, use o μl 80 de uma suspensão de 50% da proteína um Sepharose para a proteína um Sepharose/etapa obrigatória do anticorpo. Para estes cálculos, não é importante considerar a afinidade obrigatória da proteína um Sepharose (veja Tip#5).
6. Parte alíquota a proteína que amortecedor-equilibrada um Sepharose perla nos tubos do microcentrifuge. Use os tubos de 0.6 ml se o volume será menos de 0.5 ml; se não, use os tubos de 1.5 ml.
7.  Centrifugue a solução do anticorpo/extrato na velocidade máxima para o minuto 2 em um microcentrifuge para granular todo o material insolúvel (veja Tip#6).
8. Adicione o supernatant à proteína uma pasta do Sepharose.
9.   Incube para o minuto 30 na temperatura ambiente com mistura da extremidade-sobre-extremidade. Para assegurar a boa mistura durante a incubação, encha os tubos três quartos completamente de modo que uma bolha de ar mova o tubo, continuamente misturando os índices.
10.  Centrifugue as amostras para o segundo 30 ou menos em um microcentrifuge para granular os grânulos.
11.   Lave os grânulos resuspending no amortecedor da lavagem. Encha o tubo três quartos completamente.
12.   Centrifugue as amostras para uns 30 ou menos em um microcentrifuge para granular os grânulos e para remover o supernatant.
13.   Resuspend os grânulos no amortecedor da lavagem outra vez e transfira os grânulos a um tubo novo.
14.   Enxágüe os tubos velhos com mais amortecedor da lavagem e adicione essa lavagem aos tubos novos.
15.   Centrifugue os grânulos para o segundo 30 ou menos em um microcentrifuge para granular os grânulos e para remover o supernatant.
16.   Lave outra vez com amortecedor da lavagem e centrifugue os grânulos para o segundo 30 ou menos em um microcentrifuge e remova o supernatant.

Reações da quinase no material de Immunoprecipitated

1. Lave os grânulos uma ou dois vezes no amortecedor da reação da quinase H1.
2. Aspire fora de todo o supernatant.
3. Adicione o μCi γ 10 o μl do amortecedor da reação da quinase H1 que contem o ATP de 20 μM e 5 - [32P] - ATP (CUIDADO! veja Tip#7).
4. Incube a reação para o minuto 10 em 30°C.
5. Pare a reação adicionando o μl 10 do amortecedor da amostra 2X.
6. Μl da carga 8 da amostra em um gel de Polyacrylamide de 15% (veja o protocolo em SDS-PAGE).
7. Funcione o gel e processe-o para a autoradiografia (veja o protocolo na autoradiografia).

Análise do gel de Polyacrylamide do protocolo da imunoprecipitação

1. Resuspend os grânulos no amortecedor da amostra 1X.
2. Ferva as amostras para o segundo 90.
3. Centrifugue as amostras momentaneamente em um microcentrifuge.
4. Carregue as amostras em um gel do SDS-Polyacrylamide (veja o protocolo em SDS-PAGE).
5. Electrophorese o gel.
6. Seque o gel em um secador do gel.
7. Detecte a atividade da quinase pela autoradiografia (veja o protocolo na autoradiografia).

Amortecedores para o protocolo do ensaio da quinase

Amortecedor da quinase H1		1 milímetro DTT (para reter a atividade da proteína) 20 milímetros EGTA 15 milímetros de MgCl2 80 milímetros de glicerol 2-Phosphate, sal do sódio, pH 7.4
Amortecedor da amostra (2X)		2 milímetros DTT Adicione DTT imediatamente antes do uso 20% (v/v) glicerol 100 milímetros de Tris-Cl, pH 6.8 0.2% (w/v) azul do bromofenol 4% (w/v) SDS
Amortecedor da reação da quinase H1		15 milímetros de MgCl2 1 milímetro DTT 20 milímetros HEPES, pH 7.4 150 milímetros de NaCl
Amortecedor da lavagem		1 milímetro DTT 0.1% (v/v) Triton-x 100 5 milímetros EGTA 50 milímetros de Tris-Cl, pH 7.4 5 milímetros NAF 250 milímetros de NaCl

  Materiais exigidos para o método

• Triton-x 100
• Azul do bromofenol
• Glicerol
• Tris
• Cloreto do magnésio
• I3- [^32P] - ATP
• DTT
• Anticorpo
• EGTA
• ATP
• Fluoreto de sódio
• Glicerol 2-Phosphate, sal do sódio
• Cloreto de sódio
• Proteína um Sepharose
• SDS
• HEPES

Pontas do protocolo

Referências para o protocolo do ensaio da quinase