Extração de clorofórmio ácida do fenol da isolação do RNA do Thiocyanate de Guanidinium

Extração de clorofórmio ácida do fenol da isolação do RNA do Thiocyanate de Guanidinium

Método da isolação do RNA:

Protocolo passo a passo da isolação do RNA

1. Para o uso das pilhas de cultura do tecido mamífero 1 ml que desnatura a solução por 1 x 107 pilhas. Para pilhas da drosófila nós 1 ml que desnatura a solução por 1 x 108 pilhas. Para embriões ou tecido, use 1 ml que desnatura a solução por o tecido do magnésio 100 (veja a ponta #2).
2.  Homogeneize as pilhas de cultura do tecido ou da pilha usando um homogenizador do Teflon-vidro ou um homogenizador do polytron.
3. Transfira o homogenate a um tubo do polypropylene de 5 ml.
4. Adicione 0.1 ml do acetato do sódio de 2 M e misture-os completamente pela inversão.
5.  Adicione 1 ml do fenol saturado ddH2O, misture-o bem pela inversão, adicione-o 0.2 ml de SEVAG e misture-os bem pela inversão.
6.  Incube a suspensão para o minuto 15 em 0° ao °C 4 (veja a ponta #3).
7.  Centrifugue a solução em 10.000 X g em 4°C para o minuto 20 (9.000 RPM usando um rotor SS-34).
8.  Transfira a fase superior (aquosa) a um tubo fresco (veja a ponta #4).
9.  Precipite o RNA adicionando 1 ml (1 volume) do Isopropanol 100% (temperatura ambiente).
10.  Coloc as amostras em -20°C por 30 Min.
11.  Centrifugue a solução em 10.000 X g em 4°C para 20 mínimos (9.000 RPM usando um rotor SS-34) e rejeite o supernatant.
12. Dissolva a pelota do RNA em 0.3 ml que desnaturam a solução e transfira-á um tubo do microcentrifuge de 1.5 ml.
13.  Ao RNA, re-precipitate o RNA adicionando 0.3 ml do Isopropanol 100% e incubando em -20°C por 30 Min.
14.  Centrifugue a solução em 10.000 X g em 4°C para 20 mínimos (9.000 RPM usando um rotor SS-34) e rejeite o supernatant.
15. À pelota adicione 1 ml do álcool etílico de 75%, misture-o bem e incube-o para o minuto 5 a 10 na temperatura ambiente.
16.  Centrifugue a solução em 10.000 X g em 4°C para 20 mínimos (9.000 RPM usando um rotor SS-34) e rejeite o supernatant.
17. Resuspend a pelota do RNA no álcool etílico de 75% na temperatura ambiente, misture-a bem pela inversão e incube-a na temperatura ambiente para o no meio minuto 5 a 10 na temperatura ambiente.
18.  Centrifugue a solução em 10.000 X g em 4°C para 20 mínimos (9.000 RPM usando um rotor SS-34) e rejeite o supernatant.
19.  Seque a pelota do RNA em um centrifugador do vácuo por 5 a 15 Min.
20. Dissolva a pelota do RNA em 50 100 ao μl ddH2O.
21.  Dose o RNA medindo a absorvência em 260 nanômetro (veja o protocolo na quantificação do RNA) e armazene-o nas partes alíquota em -70°C.

Amortecedores da isolação do RNA

fenol saturado ddH2O		Volumes iguais da liga de ddH2O e de fenol (não use o fenol neutralizado) em um frasco de vidro marrom Use o fenol Misture bem e incube em 4°C durante a noite
70% (v/v) álcool etílico
75% (v/v) álcool etílico
SEVAG		Clorofórmio do 24:1: Álcool Isoamyl
Acetato do sódio de 2 M		Autoclave pH ao ácido 4.0 acético Glacial de utilização
10% Sarkosyl		10% (w/v) sal do sódio de N-Lauroylsarcosine
Desnaturando a solução		0.1 M 2-Mercaptoethanol* 0.5% (w/v) sal do sódio de N-Lauroylsarcosinate Thiocyanate de 4 M Guanidinium (CUIDADO! veja a ponta #1) *Add imediatamente antes do uso 25 milímetros de citrato de sódio, pH 7.0
0.75 Citrato de sódio de M

Materiais necessários para o protocolo da isolação do RNA

• Citrato de sódio
• Thiocyanate de Guanidinium
• Sarkosyl
• Álcool Isoamyl
• Álcool etílico
• Acetato do sódio
• 2-Mercaptoethanol
• Ácido clorídrico
• Clorofórmio
• Ácido acético Glacial
• Fenol

Pontas do protocolo

Referências do método