Protocolos do ensaio de GFP

O seguinte protocolo pode ser usado para o desenvolvimento das linha celular estáveis que expressam proteínas da fusão de GFP. Embora os procedimentos óptimos do transfection (por exemplo, fosfato de cálcio, electroporation, ou FuGENE 6 [ciência aplicada de Roche]) variam dependendo do tipo da pilha, este procedimento geral do transfection foi bem sucedido para o transfection estável de HeLa, das pilhas A-431, U2OS, BHK, e HT1080. - [Construção lida e expressar de proteínas da fusão de GFP]

A informação e as pontas em como usar-se GFP-etiquetaram proteínas na biologia de pilha - [lido como usar proteínas GFP-Etiquetadas na biologia de pilha]

Os componentes moleculars específicos podem eficientemente ser etiquetados por uma combinação de três métodos: transfection químico de construções da GFP-fusão, mancha dos cromossomas com a tintura ADN-específica, fluorescente Hoechst 33342, e microinjection de proteínas fluorescente conjugadas. Este procedimento fornece um exemplo de usar todos os três métodos em ordem aos componentes da etiqueta de pilhas HeLa de vida. Estes métodos devem ser seguidos na ordem apresentada, mas alguns deles podem ser omitidos quando nao necessários. - [Cromossomas Hoechst-Etiquetados imagem latente lidos e proteínas fluorescentes durante o ciclo de pilha]

Protocolo que mede a quantidade de expressão de GFP e de índice do ADN em pilhas permeabilized. Inclui: Pilhas do reparo com formaldehyde; Pilhas de Permeabilize com álcool etílico; Preparação da solução protegida do Formaldehyde de 2%. - [Medida lida da expressão de GFP e do índice do ADN em pilhas de Permeabilized]

A proteína fluorescente verde é de uso geral monitorar a expressão e a proteína de gene que traficam dentro das pilhas intatas. A proteína fluorescente de Green® do monstro é codificada por uma versão sintética melhorada do gene fluorescente verde da proteína clonado original do cavernosa de Montastrea (grande coral da estrela). - [Ensaio fluorescente lido da proteína de Green® do monstro]

O protocolo descreve especificamente por aquisição de dados para uma variação particular de GFP (EGFP) ou de verde de Oregon como um fluoróforo fornecedor, mas pode ser adaptado para a aquisição da imagem do outro cromóforo. - [Interações de sondagem lidas da proteína usando GFP e FRICÇÃO]

À vista da análise de FLIM-FRET, os componentes apropriados do doador e do autómato devem ser introduzidos em pilhas vivas ou fixas. O método da introdução depende da natureza dos componentes e do estado das pilhas. Por exemplo, o plasmídeo DNAs que codifica uma proteína do interesse fundida a uma variação de GFP pode ser introduzido em pilhas vivas pelo transfection ou pelo microinjection, visto que os anticorpos etiquetados são entregados pelo microinjection. - [Interações de sondagem lidas da proteína usando o protocolo de GFP e de FRICÇÃO]

Descreve como os componentes (fragmentos geralmente fabulosos dos anticorpos) que deve ser introduzida em pilhas são etiquetados com as tinturas fluorescentes do sulfoindocyanine. - [Interações de sondagem lidas da proteína usando GFP e FRICÇÃO.]