Protocolos Da Síntese do DNA

Para gerar "3'-extremidades que" o DNA parcial clones, mRNA reverso-é transcrito usando um primer "hybrid" (Qtotal, quarto) que consista em duas bases misturadas (GATC/GAC seguiu perto [ T]17) e uma seqüência original do oligonucleotide 35-base (QI-QO).  O amplification é executado então usando uma parte contendo mais maia bem vestido desta seqüência (Qouter, Qo) (que liga agora a cada DNA em suas 3'-extremidades) e um primer derivado do gene do interesse, GSP1 (primer gene-específico 1). - [Amplification Lido do DNA Das 3'-Extremidades Usando O Protocolo Clássico da RAÇA]

Gerar o DNA parcial das "5'-extremidades" clones usando a RAÇA clássica, os produtos da primeiro-costa é gerado pela transcrição reversa (extensão mais maia bem vestido) de um primer gene-específico sabido (GSP-RT).  Então, uma cauda do poly(A) é adicionada usando o deoxynucleotidyltransferase terminal (Tdt) e o dATP.  O amplification é realizado usando três primers. - [Amplification Lido do DNA Das 5'-Extremidades Usando O Protocolo Clássico da RAÇA]

A RAÇA nova, uma variação do RNA ligase-mediated-RACE (RLM-RACE) (Liu e Gorovsky 1993) parte da RAÇA clássica (veja o amplification do DNA das 5'-Extremidades usando a RAÇA clássica) que um primer da "escora" está unido às 5'-extremidades do mRNA antes da etapa reversa da transcrição; daqui a seqüência da escora torna-se incorporada no DNA da primeiro-costa se, e somente se, a transcrição reversa prosegue com o comprimento inteiro do mRNA do interesse. - [Amplification Lido do DNA Das 5'-Extremidades Usando O Protocolo Novo da RAÇA]

Um primer do oligodeoxynucleotide hybridized ao mRNA é estendido por um polymerase RNA-dependente do DNA para criar uma cópia do DNA que possa ser amplificada por PCR.  Dependendo da finalidade da experiência, o primer para a síntese do DNA da primeiro-costa pode especificamente ser projetado hybridize a um gene particular do alvo, ou um primer geral tal como o oligo(dT) pode ser usado aprontar essencialmente a síntese do DNA de todos os mRNAs mammalian - [amplification lido do DNA gerado por Reverso Transcrição do protocolo do mRNA]

Este método, para o amplification seletivo de extremidades full-length do DNA, envolve a adição de um adaptador durante a transcrição reversa.  Este método faz exame da vantagem do propensity do transcriptase murine do reverso do vírus do leukemia de Moloney (MMLV RT) adicionar dois a quatro cytosines às 3'-extremidades de costas recentemente synthesized do DNA.  Os resíduos adicionais são adicionados quando o enzyme alcança a estrutura 5'-cap na extremidade do molde do mRNA. - [Protocolo Lido da RAÇA Do Tampão-Cap-Switching]

Este sistema da síntese do DNA simplifica seu trabalho dramàtica.  Todos os componentes da reação são premixed e lyophylised.  Você tem que adicionar seu RNA e (para grânulos Seu-Principais) o primer.  Uma outra vantagem do sistema é um número pequeno das etapas introduzindo com pipeta requeridas, e reduziu conseqüentemente o risco da contaminação do rnase e da degradação do RNA. - [a primeira síntese lida do DNA da costa com Pronto-À-Vai protocolo dos grânulos]

Este método da primeira síntese do DNA da costa é mais eficiente do que Pronto-à-Vai grânulos.  Você pode usar tão pouco como o RNA 100ng total e detecta-o ainda expressão do gene em PCR. - [primeira síntese lida do DNA da costa com protocolo super do certificado II]

Em MOPAC, as seqüências do amino-terminal e do carboxy-terminal de um peptide são usadas projetar duas famílias redundantes dos oligonucleotides que codificam as seqüências do carboxy-terminal do aminoand do peptide.  Os primers são usados amplificar um segmento do DNA preparado por RT-PCR de um tecido sabido para expressar a proteína ou para amplificar um segmento do DNA de uma biblioteca estabelecida genomic ou do DNA. - [amplification Oligonucleotide-aprontado misturado lido do protocolo do DNA MOPAC]

As reações 3'-RACE são usadas isolar as seqüências 3' desconhecidas ou traçar os términos 3' dos mRNAs em uma seqüência do gene.  3'-RACE requer o conhecimento de uma região pequena da seqüência dentro do RNA do alvo ou de um clone parcial do DNA.  Uma população dos mRNAs é transcrita no DNA com um adaptador-adaptor-primer que consiste em sua extremidade 3' de um intervalo do poly(T) e em seu fim 5' de uma seqüência arbitrária de 30-40 nucleotides. - [o amplification rápido lido ' DNA de 3 termina o protocolo 3'-RACE]

Este método é usado estender o DNA parcial clones amplificando as seqüências 5' dos mRNAs correspondentes.  A técnica requer o conhecimento de uma região pequena da seqüência dentro do clone parcial do DNA.  Durante PCR, o polymerase thermostable do DNA é dirigido ao RNA apropriado do alvo por um único primer derivado da região da seqüência sabida. - [o amplification rápido lido ' DNA de 5 termina o protocolo 5'-RACE]

O protocolo descreve a preparação de pontas de prova subtraídas do DNA pelo hybridization a um excitador do mRNA, seguida pelo purification do DNA radiolabeled único-encalhado pelo chromatography do hydroxyapatite.  Antes de preparar a ponta de prova, é uma idéia boa ter os filtros (que contêm a biblioteca do DNA a ser selecionada) apronta-se para hybridize. - [síntese lida de pontas de prova radiolabeled, subtraídas do DNA usando Oligo(dT) como um protocolo mais mais bem vestido]