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A descoberta a mais notável feita por cientistas é a ciência própria. ~Gerard Piel
O índice de proteína de uma pilha é estimado
para consistir em milhares de tipos diferentes de proteínas
com uma escala dinâmica da expressão. A
tecnologia que está sendo usada atualmente envolve a recuperação
dos componentes de proteína, fractionation desta mistura muito
complexa,
proteolysis enzymatic de de cada espécie separada e
isolada, análise spectrometric maciça extensiva e finalmente
combinar os dados estruturais gerados de encontro a uma base de dados
de proteínas sabidas ou de produtos antecipados da expressão do
genome.
Este procedimento envolve uma etapa inicial usando 1 ou o
electrophoresis 2-dimensional (DE). Usando 1-DE, as proteínas
são separadas na base da massa molecular; a técnica é
reproducible e pode ser usada para proteínas na escala maciça do kDa–10 300, mas limitou a definição.
Para a separação de umas misturas mais complexas da proteína,
2-DE é o método preferido. Isto envolve separar as proteínas
first de acordo com sua carga líquida por uma etapa focalizar
isoelectric e então, na segunda dimensão, de acordo com sua massa
molecular que emprega o electrophoresis dodecyl do gel do
sulfate-sulfate-polyacrylamide do sodium (SDS-PAGE) que dá uma
separação elevada efficiency.
O spectrometry maciço (MS) é o método da escolha para o
identification
das proteínas separadas, e do spectrometry de 2-DE e
maciço
represente agora uma tecnologia por que diverso mil
proteínas podem ser separadas, detectado e identified em uma
forma automatizada.
A metodologia de Proteomics é feita inicialmente pela
separação e pela posição da proteína por 2-DE seguido pelo
excision das proteínas do interesse que se submetem então à
digestão proteolytic para render uma mistura de fragmentos do
peptide. Os peptides são analisados pelo spectrometry maciço,
usando inicialmente MALDI-MS para a determinação e a geração
maciças molecular de uma massa fingerprint do peptide. Se
a base de dados que procurara neste estágio render resultados
ambiguous, uma análise spectrometric da segunda massa, ESI-MS/MS,
está usada gerar a informação da seqüência que é usada para
procurarar mais estrito da base de dados.
Do spectrum da massa obtido na análise da mistura do sumário
da proteína, o mapa da massa do peptide ou o peptide
fingerprint maciço isto é as massas molecular dos fragmentos
do peptide, podem ser verificados. Frequentemente, se a
seqüência do amino-ácido for sufficiently original e a massa
a exatidão sufficiently elevada, o mapa maciço
pode ser usada procurarar bases de dados 12–15 para
identificar com sucesso a proteína sem a necessidade para umas
análises mais adicionais. Se, entretanto, procurarar da base de
dados conduz aos resultados ambiguous, a seguir umas análises mais
adicionais do MS, envolvendo o uso do spectrometry maciço em tandem
(MS/MS), são empreendidas sequencialmente em cada peptide na mistura
gerar uma seqüência, ou na seqüência parcial, sabida como um Tag
da seqüência, para estes peptides. Isto é conseguido
freqüentemente pelo uso de ESI-MS/MS19 e geralmente uma etapa
adicional de purification deve ser executada para separar os
peptides dos sais e dos detergentes que podem ser presente que causam
a atenuação do sinal do peptide.
Base de dados mais adicional que procurara com ambos a
massa molecular do peptide
e a informação do Tag da seqüência deve conduzir à
proteína unambiguous identification.
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