Técnicas da identificação da proteína

As proteínas podem ser separadas pela 2-D electroforese do gel e ser identificadas com espectrometria maciça

O índice de proteína de uma pilha é estimado para consistir em milhares de tipos diferentes de proteínas
com um alcance dinâmico da expressão. A tecnologia que está sendo usada atualmente envolve a recuperação dos componentes de proteína, fraccionamento desta mistura muito complexa,
proteolysis enzymatic de de cada espécie separada e isolada, análise spectrometric maciça extensiva e finalmente combinar os dados estruturais gerados de encontro a uma base de dados de proteínas conhecidas ou de produtos antecipados da expressão do genoma.
Este procedimento envolve um passo inicial usando 1 - ou a electroforese 2 dimensional (DE). Usando 1-DE, as proteínas são separadas com base na massa molecular; a técnica é reprodutível e pode ser usada para proteínas na escala maciça do kDa 10-300, mas limitou a definição.
Para a separação de umas misturas mais complexas da proteína, 2-DE é o método preferido. Isto envolve separar as proteínas primeiramente de acordo com sua carga líquida por uma etapa da focagem isoeléctrica e então, na segunda dimensão, de acordo com sua massa molecular que emprega a electroforese dodecyl do gel do sulfato-polyacrylamide do sódio (SDS-PAGE) que dá um effciency elevado da separação.
 A espectrometria maciça (MS) é o método de escolha para a identificação
das proteínas separadas, e da espectrometria de 2-DE e maciça
represente agora uma tecnologia por que diverso mil proteínas podem ser separadas, detectado e identificado em uma forma automatizada.
A metodologia de Proteomics é feita inicialmente pela separação e pela posição da proteína por 2-DE seguido pela excisão das proteínas do interesse que se submetem então à digestão proteolytic para render uma mistura de fragmentos do peptide. Os peptides são analisados pela espectrometria maciça, usando inicialmente MALDI-MS para a determinação da massa molecular e a geração de uma impressão digital da massa do peptide. Se a base de dados que procurara nesta fase rende resultados ambíguos, uma análise spectrometric da segunda massa, ESI-MS/MS, está usada para gerar a informação da seqüência que é usada para uma pesquisa mais estrita da base de dados.
Do espectro maciço obtido na análise da mistura do sumário da proteína, o mapa da massa do peptide ou a impressão digital maciça do peptide isto é as massas moleculars dos fragmentos do peptide, podem ser verificados. Frequentemente, se a seqüência de ácido aminado é suffciently original e a massa
a exatidão suffciently altamente, o mapa maciço pode ser usada para procurarar bases de dados 12-15 para identificar com sucesso a proteína sem a necessidade para umas análises mais adicionais. Se, entretanto, a pesquisa da base de dados conduz aos resultados ambíguos, a seguir umas análises mais adicionais do MS, envolvendo o uso da espectrometria maciça em tandem (MS/MS), são empreendidas sequencialmente em cada peptide na mistura gerar uma seqüência, ou na seqüência parcial, conhecida como um Tag da seqüência, para estes peptides. Isto é conseguido freqüentemente pelo uso de ESI-MS/MS19 e geralmente uma etapa adicional da purificação deve ser executada para separar os peptides dos sais e dos detergentes que podem estar presente que causam a atenuação do sinal do peptide.

Base de dados mais adicional que procurara com ambos a massa molecular do peptide
e a informação do Tag da seqüência deve conduzir à identificação inequívoca da proteína.