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Técnicas Da Identificação Da Proteína

As proteínas podem ser seperated pelo 2-D electrophoresis do gel e identificado com spectrometry maciço

O índice de proteína de uma pilha é estimado para consistir em milhares de tipos diferentes de proteínas
com uma escala dinâmica da expressão. A tecnologia que está sendo usada atualmente envolve a recuperação dos componentes de proteína, fractionation desta mistura muito complexa,
proteolysis enzymatic de de cada espécie separada e isolada, análise spectrometric maciça extensiva e finalmente combinar os dados estruturais gerados de encontro a uma base de dados de proteínas sabidas ou de produtos antecipados da expressão do genome.
Este procedimento envolve uma etapa inicial usando 1 ou o electrophoresis 2-dimensional (DE). Usando 1-DE, as proteínas são separadas na base da massa molecular; a técnica é reproducible e pode ser usada para proteínas na escala maciça do kDa–10 300, mas limitou a definição.
Para a separação de umas misturas mais complexas da proteína, 2-DE é o método preferido. Isto envolve separar as proteínas first de acordo com sua carga líquida por uma etapa focalizar isoelectric e então, na segunda dimensão, de acordo com sua massa molecular que emprega o electrophoresis dodecyl do gel do sulfate-sulfate-polyacrylamide do sodium (SDS-PAGE) que dá uma separação elevada efficiency.
 O spectrometry maciço (MS) é o método da escolha para o identification
das proteínas separadas, e do spectrometry de 2-DE e maciço
represente agora uma tecnologia por que diverso mil proteínas podem ser separadas, detectado e identified em uma forma automatizada.
A metodologia de Proteomics é feita inicialmente pela separação e pela posição da proteína por 2-DE seguido pelo excision das proteínas do interesse que se submetem então à digestão proteolytic para render uma mistura de fragmentos do peptide. Os peptides são analisados pelo spectrometry maciço, usando inicialmente MALDI-MS para a determinação e a geração maciças molecular de uma massa fingerprint do peptide. Se a base de dados que procurara neste estágio render resultados ambiguous, uma análise spectrometric da segunda massa, ESI-MS/MS, está usada gerar a informação da seqüência que é usada para procurarar mais estrito da base de dados.
Do spectrum da massa obtido na análise da mistura do sumário da proteína, o mapa da massa do peptide ou o peptide fingerprint maciço isto é as massas molecular dos fragmentos do peptide, podem ser verificados. Frequentemente, se a seqüência do amino-ácido for sufficiently original e a massa
a exatidão sufficiently elevada, o mapa maciço pode ser usada procurarar bases de dados 12–15 para identificar com sucesso a proteína sem a necessidade para umas análises mais adicionais. Se, entretanto, procurarar da base de dados conduz aos resultados ambiguous, a seguir umas análises mais adicionais do MS, envolvendo o uso do spectrometry maciço em tandem (MS/MS), são empreendidas sequencialmente em cada peptide na mistura gerar uma seqüência, ou na seqüência parcial, sabida como um Tag da seqüência, para estes peptides. Isto é conseguido freqüentemente pelo uso de ESI-MS/MS19 e geralmente uma etapa adicional de purification deve ser executada para separar os peptides dos sais e dos detergentes que podem ser presente que causam a atenuação do sinal do peptide.

Base de dados mais adicional que procurara com ambos a massa molecular do peptide
e a informação do Tag da seqüência deve conduzir à proteína unambiguous identification.