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2-D Electrophoresis Bidimensional Do Gel

O electrophoresis bidimensional do gel (chamado também abreviado como o 2-D electrophoresis ou 2-DE) é um método do electrophoresis do gel que é usado geralmente separar ou analisar muito similar no tamanho, e também muitas proteínas tais como o jogo completo das proteínas atuais em uma pilha dada uma vez no tempo, o proteome.

o 2-D electrophoresis do gel separa as proteínas em duas dimensões, no ponto isoelectric e na massa. Isto permite a separação das proteínas que de outra maneira não poderiam ser separadas ou distinguido nos gels 1-D, including proteínas similarmente feitas sob medida e muitas proteínas (tais como um proteome).

2-D Índice do gel

• 2-D Fundo Do Electrophoresis Do Gel
• 2-D Artigos Do Gel
• Separação por Isoelectric Ponto
• Métodos Manchando Do Electrophoresis Bidimensional Do Gel
• 2-D Protocolo Do Electrophoresis Do Gel
• Outros 2-D Protocolos Do Electrophoresis Do Gel
• 2-D Gels De Pesquisa de defeitos
• 2-D Forum do electrophoresis do gel (você pode fazer toda a pergunta sobre o 2-D aqui! Junte também a lista enviando para receber até as perguntas e as respostas do dia em 2-D gels de outros investigadores e peritos da ciência!)

Fundo Bidimensional Do Electrophoresis Do Gel

O electrophoresis de todas as proteínas celulares através de um SDS-sDS-gel pode separar as proteínas que têm diferenças relativamente grandes no peso molecular entretanto, ele não pode prontamente resolver as proteínas que têm os pesos similares (por exemplo uma proteína 53-kDA de uma proteína 52-kDA).

No método do electrophoresis do gel do 1D, as proteínas são separadas em uma dimensão (que é elas é separada pela massa somente).

No 2-D electrophoresis, a separação começa com o electrophoresis 1-D entretanto lá é uma segunda separação que ocorra, separando as proteínas pela carga em um sentido 90 graus do primeira.

O resultado é que os analytes estão espalhados para fora através de uma superfície bidimensional melhor que ao longo de uma linha. Assim, devido ao fato que as proteínas estão separadas por não somente maciço mas também pela carga, é improvável que haverá mais de uma proteína em uma dada o ponto no 2-D gel. Isto é porque é improvável que duas proteínas compartilhariam não somente da mesma massa exata mas também do mesma carga.

Conseqüentemente, em um 2-D gel, os analytes são separados mais eficazmente no 2-D electrophoresis do que no electrophoresis 1-D devido à segunda etapa da separação pela carga.

O 2-D método da separação do gel por Isoelectric Ponto

A fim separar proteínas de uma massa similar, uma outra característica física das proteínas deve ser usada. Uma outra propriedade física importante da proteína que possa ser usada na separação é a carga elétrica, que é determinada pelo número de resíduos acidic e básicos em uma proteína e em sua carga do grupo.

Duas proteínas unrelated que têm massas similares são improváveis ter cargas líquidas idênticas porque sua seqüência do amino-ácido seria diferente, e assim a carga e o número de resíduos acidic e básicos dariam uma carga líquida diferente. Isto permitiria que estas proteínas fossem separadas pelo 2-D, mas não pelo electrophoresis do gel 1-D.

No 2-D método da separação do gel, as proteínas são separadas realmente pelo ponto isoelectric (o ponto isoelectric (pI) é o pH em que uma molécula ou uma superfície particular não carregam nenhuma carga elétrica líquida).

Um gradient do pH é aplicado a um gel e um potencial elétrico é aplicado através do gel, fazendo uma extremidade mais positiva do que a outra. Em todo o aother dos pHs do que seu ponto isoelectric, as proteínas serão carregadas. Se forem carregados positivamente, estarão puxados para a extremidade mais negativa do gel e se forem carregados negativamente serão puxados para a extremidade mais positiva do gel. Uma vez que alcançam a região do gel com o pH que corresponde a seu ponto isoelectric, entretanto, tornar-se-ão carregados neutraly e remanescer-se-ão nesse ponto.

2-D Métodos Manchando Do Electrophoresis Do Gel

Protocolos da deteção da proteína para o electrophoresis bidimensional

Após a separação, as proteínas são separadas para fora no 2-D gel, porém seja invisível ao olho despido. Para visualizar as proteínas no gel, os métodos muito sensíveis manchar e de deteção das proteínas devem ser realizados.

Isto é devido a diversos fatos:

1. As pistas do gel podem somente aceitar algum volume do lysate da pilha ou da solução da proteína.
2. Embora o lysate/solution possa precipitated e concentrado para carregar mais proteína, menos proteína está carregada geralmente no 2D gel enquanto as quantidades excessivas da proteína fazem difícil de analisar o gel devido aos tamanhos grandes do ponto.
3. A separação de uma quantidade grande de proteína (mgs), ou mesmo os milhares de proteínas diferentes de uma pista pequena, em um gel relativamente grande do dimensionsional dois geram pontos das proteínas que são abudance/concentração muito baixos (ng ou os picograms!) isso é impossível ou difícil de detectar por manchas ordinárias ou por métodos de deteção da proteína.
4. Uma abundância baixa/copía baixo a proteína do número pode ser separada, mas não pode mesmo ser detectado devido ao fato que as manchas as mais sensíveis têm somente um limite de deteção aproximadamente de um 1/2 um nanogram. Os níveis do ponto de Picogram são atualmente muito difíceis ou impossíveis detectar com manchar.

No 2D electrophoresis, as manchas muito sensíveis são requeridas conseqüentemente. Estas proteínas podem então ser detectadas por uma variedade dos meios, mas o mais comum é mancha manchar e de coomasie da prata.

2D Gels Manchando De prata

Em manchar de prata do 2-D gel, um colóide de prata é aplicado ao gel. A prata liga-se aos grupos do cysteine dentro da proteína. A prata é escurecida então pela exposição à luz UV. A escuridão da prata no ponto, pode ser relacionada à quantidade de prata e conseqüentemente à quantidade de proteína em uma posição dada no gel. Esta lata da medida dá somente quantidades aproximadas, mas é adequada para a maioria de finalidades.

Manchar de Coomasie de 2D gels

A tintura de Coomassie liga às proteínas através do physisorption aos aminos-ácido tais como os aminos-ácido, a arginina, e o histidine aromatic. Coomasie é usado também no método de Bradford. As manchas non-toxic sensíveis do coomasie foram geradas que permitem o visualization dos pontos que contêm menos de 1 ng da proteína.

Manchar de SYPRO de 2D gels

O RUBY de SYPRO é uma 2D mancha muito sensível do método de deteção da proteína, permitindo a visualization de aproximadamente 1/2 um o ng da proteína em um ponto dado. A desvantagem é o método requer a luz UV visualizar a mancha, assim requerendo o uso de uma luz UV. Isto faz o corte dos pontos difícil e potencial perigoso devido à exposição UV possível.

 

2-D Protocolo Do Electrophoresis Do Gel

Um protocolo bidimensional do electrophoresis do gel para 7 cm IPG descasca detetar do GE de Amersham.

2D Preparação Da Amostra Do Gel

• As amostras da proteína geralmente necessitam ser desalted ou dializaram. O dialysis pode ser conduzido com os sacos grandes do dialysis para volumes grandes, ou o mini deslizam-um-lyzer (perfure) para volumes pequenos.
• O dialysis foi conduzido com 1 litro do bicarbonato do ammonium de 0.3mM sobre 30 minutos onde se usar desliza-um-lyzer jogos do dialysis (perfure).
• Após o dialysis, as amostras lyophilized usando um lyophilizer para 1 ½ horas.
• As amostras lyophilized reconstituted então com 400 litros amortecedor do rehydration.

 

Focalizar IsoElectric de IEF

Etapa 1. Rehydration de tiras de IPG

• A bandeja isoelectrofocusing do rehydration do drystrip foi limpada com cuidado com a solução da limpeza de IPGphor (GE de Amersham que deteta).
• Certifique-se que a bandeja está nao molhada seco, porque a amostra migrará ao longo das canaletas da água.
• Introduza com pipeta 125 litros na área circular da bandeja.
• Usando tweezers, remova com cuidado as tiras de IPG do protetor plástico.
• As tiras de algum IPG têm um coversheet plástico ou descascam proteger o lado do gel. Remova estes forceps/tweezers usando-se antes de usar estas tiras.
• Coloque delicadamente o lado do gel da tira para baixo na amostra.
• Remova todas as bolhas.
• Coloque na extremidade do óleo mineral da pista da bandeja e certifique-se você impulso que traga a pista até que cubra completamente a tira de IPG. Certifique-se que as folhas de prova do óleo mineral a tira do todo como esta impede a evaporação durante o rehydration pisam.

 

 

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