Membranas ocidentais de descascamento do borrão

O descascamento da membrana é a remoção dos anticorpos (incluir preliminar e secundário) de uma membrana ocidental do borrão, para permitir a incubação de anticorpos preliminares e secundários novos para o ensaio de uma proteína nova pela mancha ocidental.

A electroforese do gel do Agarose é usada principalmente na análise ou na separação de moléculas do ADN e do RNA (embora as proteínas podem igualmente ser separadas em geles do agarose), porém a separação igualmente permite a purificação de tamanhos específicos de DNAs após a digestão da enzima da limitação. Isto é usado geralmente em clonar para obter os plasmídeo do corte, em que a electroforese do gel do agarose separa vetores do corte dos uncut.

Assim descascar reserva:

1. Reusar das membranas ocidentais do borrão a analisar para a expressão de uma outra proteína
2. Ao ensaio para a proteína total
3. Para analisar para a proteína não-phosphorylated (após a análise para proteína phosphorylated).

Descascar exige amortecedores e a incubação especiais em um forno.

Os amortecedores usaram-se:

Amortecedor de descascamento

• Tris-HCl de 62.5 milímetros (pH 6.8)
• 2% SDS. (adicione ul 280 do beta merceptoethanol 2 ou de uma concentração final de 0.1 M 2-Mecaptoethanol).

• adicione o μl 280 do beta-mercaptoethanol 2 por 40 mL do amortecedor de descascamento (a uma concentração final de 100 milímetros)
• 1. Lave a membrana em TBST (1 x o minuto 5)
  2. Incube a membrana no amortecedor de descascamento para o minuto 30 em 50-60°C (use um forno do aquecimento para este - e mantenha o devido fechado da porta do forno cheirar)
  3. Lave em TBST (2 x o minuto 5)
  4. Obstrua a membrana para 1 h no leite de obstrução de 5%
  5. Siga o protocolo normal para desenvolver borrões ocidentais.