Borrão ocidental

Aprenda agora que tudo mais lá é sobre borrões ocidentais!

- Amostra Prepartation

- Lysing o amortecedor

- Anticorpo

- Lysing pilhas

- Preparação do gel

- Gel de funcionamento

- Transferência do gel

- Controles

- Borrão ocidental

- Readout

- Análise e interpretação

Se você tem pilhas Não-aderentes (tais como linhas de célula T ou glóbulos periféricos) ou pilhas aderentes (tais como pilhas do fibroblasto ou pilhas de COS), você precisa de remover as proteínas estranhas dos media. Para pilhas não-aderentes você pode delicadamente granulá-las com centrifugação e então lavar a pelota com PBS. Para pilhas aderentes, a lavagem simples a garrafa ou o prato com o PBS antes do borrão ocidental.

A análise ocidental do borrão examina proteínas, e assim que nós queremos as proteínas ser liberação das pilhas e impedir igualmente que as proteínas estejam cortadas acima por proteases. Nós precisamos estes ao borrão ocidental:

- para manter coisas frias! 4C no gelo durante o lysis da pilha para a mancha ocidental

- use o detergente para quebrar acima as membranas das pilhas para liberar proteínas

- Amortecedor

- Inibidores (inibidores de protease e inibidores da fosfatase se nós faremos o borrão ocidental para phospho-proteins)

Detergente - Lysing pilhas para o borrão ocidental

O SDS e RIPA são os detergentes que são usados para solubilize proteínas para uma análise mais atrasada usando a mancha ocidental. Isto é exigido tantas como proteínas é dentro da pilha ou das membranas de pilha internas encontradas, assim que nós precisamos de liberar estas proteínas para poder ao immunoblot para elas.

Você deve selecionar um anticorpo para usar-se para o borrão ocidental. Geralmente os anticorpos monoclonais do rato ou os anticorpos polyclonal do coelho são usados.

Você pode usar ou um anticorpo sem nenhuns grupos adicionados, ou use um anticorpo que seja conjugado à biotina. Estes anticorpos não exigem

Polyclonal contra anticorpos monoclonais para o borrão ocidental

Os anticorpos monoclonais são geralmente melhores para a mancha ocidental devido a:

- melhor sinal à relação de ruído (mais baixo fundo no borrão ocidental)

- sua especificidade mais elevada (você começ menos proteínas ou Ig de contaminação)

- resultados totais do líquido de limpeza na película de mancha ocidental (faixas menos não específicas detectadas)

Os anticorpos Polyclonal são seridos melhor para a imunoprecipitação:

- reconhecem mais resumos

- tenha uma avidez mais elevada

As PONTAS antes de você lyse para a mancha ocidental:

Se você está indo ao borrão ocidental para a massa da proteína (IE uma proteína que não seja phosphorylated):

- você pode lyse nos volumes maiores (que mantêm o descanso para borrar para outras proteínas)

Se você está indo ao borrão ocidental um phospho-protein (ou proteína phosphorylated) é importante fazer o seguinte:

- certifique-se de você inibidores da fosfatase do uso (tais como o vanadate porque as fosfatase removerão os fosfatos de suas proteínas! )

- igualmente lyse pilhas no volume o menor possível (o IE lyse no amortecedor do carregamento do ul 100, este é feito porque você pode carregar a maioria das pilhas que você lysed. Isto é por mais importante que o sinal seja completamente fraco quando a mancha ocidental para phospho-proteins.)

Se você está olhando interações da proteína-proteína:

- não use o SDS como separa interações da proteína-proteína e as proteínas são desnaturadas assim (especial após a ebulição)

- para interações de mancha ocidentais da proteína-proteína, interações nativas do IE você deve usar um detergente menos-estrito tal RIPA.

Lysing:

- pode ser feito diretamente na placa ou no prato

- granule as pilhas

- Mantenha no gelo e no frio - use uma cubeta de gelo

- Regra empírica para que quanto amortecedor do lysis se use é: 10^5 pilhas/uL do amortecedor do lysis

- colete nos tubos do eppendorf e etiquete (mantenha estes no gelo)

Meça a proteína total antes da análise ocidental do borrão:

- isto permite uma análise mais quantitativa se você quer comparar condições do tratamento na análise ocidental do borrão

- os jogos comerciais estão disponíveis como um ensaio de Bradford para medir a proteína total (do Bio-Rad)

- 0.1% do SDS ou maior podem interferir com a medida da proteína

Desnature amostras da proteína:

- adicione o amortecedor da amostra do carregamento da proteína a uma parte alíquota do lysate da pilha - contem a tintura (veja demasiado a migração em um gel, 2% SDS)

- adicione o agente de diminuição do bissulfeto tal como beta - mercaptoethanol

- Fervura no bloco do banho maria ou do aquecimento (mais baixas temperaturas tais como meados de - 90 graus diminuem a agregação da proteína).

- Pique um furo no tampão de cada tubo para impedir estalar

Os geles de SDS-PAGE são as matrizes do gel que são usadas para separar proteínas pelo tamanho na presença da corrente elétrica. Os baixos geles da porcentagem separam proteínas maiores visto que uns geles mais elevados da porcentagem separam proteínas menores melhor. O problema é que todas as proteínas têm carregado associado com eles, e em uma corrente elétrica esta poderia causar problemas. Isto é resolvido pela adição de SDS às amostras da proteína. O SDS liga às proteínas cada poucos ácidos aminados e neutraliza as diferenças da carga que as proteínas têm. Isto permite que as proteínas sejam separadas pelo tamanho e não pela carga.

- dependendo do quanto proteína você quererá carregar para a mancha ocidental, você deve usar pentes pequenos ou pentes maiores.

- a porcentagem do acrilamido é importante. O acrilamido de geralmente 10% é usado.

- Um gel de resolução é usado na parte inferior com um pH de 8.8

- Um pH de empilhamento 6.8 do gel (4-5%) é usado para embalar dentro proteínas junto após o carregamento

- A polimerização dos geles é aumentada pelos catalizadores os APS e os TEMED que aceleram a reação da polimerização (formação e solidificação) do gel de poly-acrylamide.

- Carregue cada amostra com cuidado e para impedir lentamente a amostra que escapa fora da pista.

- Carregue cada pista e use o amortecedor da amostra em cada um (para impedir dentro diferenças).

1. Centrifugue amostras para o segundo 10 após a ebulição.
2. Carregue a amostra em cada pista
3. Carregue a referência do MW
4. Funcione o gel em 100V (tensão constante) ou mesmo melhore-o em 40 miliampères (corrente constante). Preste atenção ao marcador/escada da proteína ou tinja a parte dianteira para que quando pare o gel. A corrente constante dá melhores e resultados mais afiados se você tem o tempo.

- relógio para bolhas entre o vidro e sob o gel - isto significa que está trabalhando

- relógio para a migração da proteína (deve ir para baixo) - se não você comutou as ligações e pode perder todas suas amostras!

- Funcione inicialmente lentamente através do gel de empilhamento (~ 50 volts), este dá umas faixas mais afiadas.

- Não funcione durante a noite

- Não superaqueça o gel (isto faz com que o gel perca a rigidez, conduzindo aos pobres que resoloving e às faixas ruim dadas forma obscuras)

Selecione o tipo da membrana:

Pode usar qualquer um:

- Membrana de PVDF para borrões ocidentais

- Membrana da nitrocelulose para borrões ocidentais

- Membrana de nylon (usada raramente agora - pode rasgar)

Pontas para transferir à membrana ocidental:

- Luvas do desgaste em todas as vezes! Use o fórceps

- Minimize o toque/fórceps à membrana

Ordem de transferência Bio-RAD:

(-)
esponja no preto
papel de filtro
nitrocelulose do gel
papel de filtro
esponja
(+)

Transferência:

- Mantenha fresco em 4C

- Transferência durante a noite em 35 V

- Pode transferir rapidamente em 1 hora em um V mais elevado

A obstrução das membranas permite que você maximize o sinal: relação do ruído

- luvas do desgaste

- Bloco com o 5% mamado (leite seco non-fat - pó) ou o 1 - o 5% BSA (albumina de soro bovino) para proteínas phosphorylated.

- O amortecedor é TBST

Lavagem após a obstrução

- lavar após ter obstruído etapas não é crítico, porque bloco dos povos frequentemente durante incubação preliminares do anticorpo.

- a lavagem é feita geralmente com amortecedor de TBST. Pode ser feito rapidamente com um grande volume de TBST.

Incubação com anticorpo preliminar

- rato, coelho ou a outra espécie

- geralmente 1: diluição 1000 com TBST

- se o fundo elevado/muitas faixas não específicas é um problema, as incubação podem ser feitas com 5% BSA ou leite.

Lavagem após o anticorpo preliminar

- não tão crítico

- pode lavar rapidamente com grandes volumes de TBST

Incubação do anticorpo secundário

- 1 geralmente diluído: 10, 000 com TBST

- anti-rato, anti-coelho, ou o outro anticorpo conjugado com a enzima de HRP para a deteção

Lavagem após o anticorpo secundário

- CRÍTICO

- Lavagem 5 X por 5 minutos com TBST.

- Se você realmente deve se apressar, para lavar pelo menos 3 vezes com volumes maiores de TBST.

Análise para resultados

- o ECL (quimioluminescência realçada) é usado geralmente

- a película é expor e desenvolvida. A exposição por 10 segundos é geralmente bastante para a proteína total. Os Phospho-proteins podem exigir 2 - 20 exposições minutos.

- a película é geralmente XOMAT ou película “rápida” similar

WB - borrão ocidental

IB - immunoblot (um outro termo para a mancha ocidental)

SDS - Sulfato Dodecyl de sódio (um detergente usado em muitas soluções de mancha ocidentais)

PÁGINA - electroforese do gel de Polyacrilamide

Ab - Anticorpo (os anticorpos são usados para detectar sua proteína do interesse)

HRP - Peroxidase do Radish de cavalo

Luminol - carcaça que HRP se fende para causar a formação clara

ECL - Quimioluminescência realçada (solução ocidental do borrão de que realça a formação clara HRP + Luminol)

kD/kDa - kilodalton (a maioria de média das proteínas entre o kDa 30 - 80)

RAM - anti-rato Ig do coelho

Ig - imunoglobulina (um isotipo do anticorpo)

NP-40 - Nonidet P-40

PMSF - fluoreto do phenylmethylsulfonyl

BSA - Albumina de soro bovino

NFDM - Leite seco Non-fat