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Veja também: Ligações relacionadas aos locais externos: Borrão Ocidental

Borrão Ocidental

ÁUDIO: Escute uma explanação ocidental detalhada do borrão! Cortesia: Instituto De Pesquisa Humano Nacional Do Genome.

Definição Ocidental Do Borrão: Borrar ocidental é uma técnica usada identificar e encontrar as proteínas baseadas em sua abilidade de ligar aos antibodies específicos.

   A análise ocidental do borrão pode detectar sua proteína do interesse de uma mistura de um grande número de proteínas.  Borrar ocidental pode dar-lhe a informação sobre o tamanho de sua proteína (com comparação com um marcador ou uma escada do tamanho no kDa), e dá-lhe também a informação na expressão da proteína (com comparação com um controle tal como amostra untreated ou um outro tipo ou tecido da pilha). 

Sumário: O borrão ocidental dá-lhe a informação no:

Tamanho de sua proteína

Uma quantidade da expressão de sua proteína

A análise ocidental do borrão pode analisar toda a amostra da proteína se das pilhas ou dos tecidos, mas também pode analisar as proteínas recombinant synthesized em vitro. O borrão ocidental é dependente da qualidade do antibody que você se usa sondar para sua proteína do interesse, e como o específico ele é para esta proteína. Os antibodies são agora fàcilmente obteníveis das fontes comerciais, e você pode comprar um para sua proteína do interesse. Se sua proteína for uma proteína da novela, você deve produzir um antibody você mesmo ou começar uma companhia fazê-la para você. Neste caso você necessitará ao menos um pouco de sua proteína purified dos extratos da pilha ou feita como um recombinant (IE em vitro ou em um sistema recombinant da expressão da proteína).   Os antibodies específicos a sua proteína são vitais a borrar ocidental porque podem ligar especificamente a sua proteína do interesse em vez dos milhares das proteínas em seu borrão ocidental!

Figura 1. Detalhes das etapas envolvidas em obter a proteína para o borrão ocidental.

  Figura 2. Figure detalhar as etapas em conduzir um borrão ocidental.

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Como Borrar Ocidental Trabalha?

Veja o diagrama 1 abaixo. Primeiras coisas primeiras. Obtenha uma amostra que da proteína você quer analisar, como amostras da pilha. Lyse as pilhas para liberar índices de proteína. Funcione estes em um gel que separe proteínas na base do tamanho. Transfira então estas proteínas do gel em uma membrana usando a eletricidade. Esta membrana pode então ser usada sondar para proteínas do interesse usando um antibody preliminar.

O que você necessita o borrão ocidental:

Uma Amostra Da Proteína

Um antibody bom para detectar sua proteína do interesse

O borrão ocidental confia no antibody preliminar para detectar esta proteína dos milhares das proteínas em sua membrana e previamente em seu gel! (uma pilha pode conter 30.000 proteínas diferentes - e estas mesmas proteínas podem mesmo ser alteradas dando o sobre 300.000 proteínas diferentes!). Usar um antibody reconhece seu antibody preliminar (um antibody secundário) que você constrói acima de um sanduíche do proteína-antibody-protein-antibody-antibody!  O antibody secundário tem um enzyme do peroxidase do radish de cavalo que convirta uma carcaça do luminol a uma substância se liberando clara! Esta luz é detectada como um ponto na película. Deste ponto você pode determinar quanto proteína está lá relativo a outros pontos, ou o tamanho da proteína relativo a um marcador do tamanho que seja funcionado também no gel.

O diagrama 2 mostra um gel ocidental do exemplo do borrão. A pista 1 é uma escada do marcador do tamanho da proteína que mostre tamanhos sabidos diferentes das proteínas, isto pode ser comprada comercialmente e os tamanhos de todos os pontos são dados em um panfleto. A pista 3 é uma amostra do cancer e a pista 5 é uma amostra normal. Como você pode ver a proteína na pista 3 tem uma expressão mais elevada do que a amostra do cancer na pista 5, que é interessante. Também, os pontos da proteína nas pistas 3 e 5 são do mesmo tamanho como o ò ponto na escada do tamanho da pista 1. Nós podemos então olhar o tamanho sabido da proteína de nosso folheto que nós recebemos com a escada. Nós determinamos então que o tamanho da proteína é o kDa 80. Nossa proteína do interesse é também o kDa 80. Assim nós sabemos que o borrão ocidental trabalhou e que a proteína está expressada altamente em uma amostra do cancer!

Para detectar sua proteína:

Compre um antibody de encontro a sua fonte preliminar do antibody

Use um ECL - jogo e película do chemiluminescence começar os resultados

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Diagrama 1.                                                                                                                                      Diagrama 2.

Aprenda agora que tudo mais lá é sobre borrões ocidentais!

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Índice, em ordem feita para o borrão ocidental:

Etapas em borrar ocidental:

- preparando-se para o borrão ocidental

- que antibody a se usar para borrões ocidentais

- lysing pilhas para o borrão ocidental

- Informação Do Gel de SDS-PAGE

- preparação do gel de SDS-PAGE para borrões ocidentais

- electrophoresis do gel - funcionando o gel

- Tranfer das proteínas à membrana para borrar ocidental

- Borrão Ocidental

Termos e definições usados na análise ocidental do borrão

Os Tópicos Ocidentais Os mais atrasados Do Borrão!

 

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Etapas na análise ocidental do borrão:

- Amostra Prepartation

- Lysing O Amortecedor

- antibody

- Lysing Pilhas

- Preparação Do Gel

- Gel Funcionando

- transferência do gel

- controles

- Borrão Ocidental

- readout

- análise e interpretação

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Para preparar amostras para o borrão ocidental:

Se você tem pilhas Non-non-adherent (tais como linhas da T-pilha ou pilhas de sangue periféricas) ou pilhas adherent (tais como pilhas do fibroblast ou pilhas de COS), você necessita remover as proteínas estranhas dos media. Para pilhas non-non-adherent você pode delicadamente pellet as com centrifugation e então lavar a pelota com PBS. Para pilhas adherent, a lavagem simples o flask ou o prato com o PBS antes do borrão ocidental.

 

A análise ocidental do borrão examina proteínas, e assim que nós queremos as proteínas ser liberação das pilhas e impedir também que as proteínas estejam cortadas acima por proteases. Nós necessitamos estes ao borrão ocidental:

- para manter coisas frias! 4C no gelo durante o lysis da pilha para borrar ocidental

- use o detergente quebrar acima as membranas das pilhas para liberar proteínas

- amortecedor

- inibidores ( inibidores do protease e inibidores do phosphatase se nós fizermos o borrão ocidental para phospho-proteins)

 

Detergente - Lysing Pilhas Para O Borrão Ocidental

O SDS e RIPA são os detergentes que são usados solubilize proteínas para uma análise mais atrasada usando borrar ocidental. Isto é requerido tantas como proteínas é dentro da pilha ou das membranas internas encontradas da pilha, assim que nós necessitamos liberar estas proteínas para poder ao immunoblot para elas.

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Que antibody devo eu usar para borrar ocidental?

Você deve selecionar um antibody para usar-se para o borrão ocidental. Geralmente os antibodies monoclonal do rato ou os antibodies do polyclonal do coelho são usados.

Você pode usar ou um antibody sem nenhuns grupos adicionados, ou use um antibody que conjugated ao biotin. Estes antibodies não requerem

 

Polyclonal contra antibodies monoclonal para o borrão ocidental

Os antibodies monoclonal são geralmente melhores para borrar ocidental devido a:

- sinal melhor à relação de ruído (fundo mais baixo no borrão ocidental)

- seu specificity mais elevado (você começa menos proteínas ou Ig contaminando)

- resultados totais do líquido de limpeza na película borrando ocidental (faixas mais menos non-specific detectadas)

 

Os antibodies de Polyclonal são servidos mais melhor para o immunoprecipitation:

- reconhecem mais epitopes

- tenha um avidity mais elevado

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Lysing pilhas para o borrão ocidental:

As PONTAS antes de você lyse para borrar ocidental:

Se você estiver indo ao borrão ocidental para a massa da proteína (IE uma proteína que não seja phosphorylated):

- você pode lyse nos volumes maiores (que mantêm o descanso para borrar para outras proteínas)

 

Se você estiver indo ao borrão ocidental um phospho-protein (ou proteína phosphorylated) é importante fazer o seguinte:

- certifica-se você inibidores do phosphatase do uso (tais como o vanadate porque os phosphatases removerão os phosphates de suas proteínas! )

- lyse também pilhas no volume o menor possível (o IE lyse no amortecedor do carregamento do ul 100, este é feito porque você pode carregar a maioria das pilhas que você lysed. Isto é por mais importante que o sinal seja completamente fraco quando borrar ocidental para phospho-proteins.)

 

Se você estiver olhando interações da proteína-proteína:

- não use o SDS como dissociates interações da proteína-proteína e as proteínas são desnaturadas assim (especial após ferver)

- para interações borrando ocidentais da proteína-proteína, interações nativas do IE você deve usar um detergente menos-estrito tal RIPA.

 

Lysing:

- pode ser feito diretamente na placa ou no prato

- pellet as pilhas

- mantenha no gelo e no frio - use uma cubeta de gelo

- régua de polegar para que quanto amortecedor do lysis se use é: pilhas 10^5/uL do amortecedor do lysis

- colete nos tubos e na etiqueta do eppendorf (mantenha estes no gelo)

 

Meça a proteína total antes da análise ocidental do borrão:

- isto permite a análise mais quantitative se você quiser comparar condições do tratamento na análise ocidental do borrão

- os jogos comerciais estão disponíveis como um assay de Bradford para medir a proteína total (do Bio-Bio-Rad)

- 0.1% do SDS ou de uma lata mais grande interferem com a medida da proteína

 

Desnature Amostras Da Proteína:

- adicione o amortecedor da amostra do carregamento da proteína a um aliquot do lysate da pilha - contem a tintura (veja demasiado a migração em um gel, 2% SDS)

- adicione o agente reduzindo-se do bissulfeto tal como beta - mercaptoethanol

- fervura no banho da água ou no bloco do heating (temperaturas mais baixas tais como mid - 90 graus diminuem o aggregation da proteína).

- pique um furo no tampão de cada tubo para impedir estalar

 

Informação do gel de SDS-PAGE para borrar ocidental

Os gels de SDS-PAGE são as matrizes do gel que são usadas separar proteínas pelo tamanho na presença da corrente elétrica. Os gels baixos da porcentagem separam proteínas maiores visto que uns gels mais elevados da porcentagem separam proteínas menores mais melhor. O problema é que todas as proteínas têm carregado associado com eles, e em uma corrente elétrica esta poderia causar problemas. Isto é resolvido pela adição do SDS às amostras da proteína. O SDS liga às proteínas cada poucos aminos-ácido e neutraliza as diferenças da carga que as proteínas têm. Isto permite que as proteínas sejam separadas pelo tamanho e não pela carga.

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Preparação do gel de SDS-PAGE para o borrão ocidental

- dependendo do quanto proteína você quererá carregar para borrar ocidental, você deve usar combs pequenos ou combs maiores.

- a porcentagem do acrilamido é importante. O acrilamido de geralmente 10% é usado.

- um gel resolvendo é usado no fundo com um pH de 8.8

- um gel de empilhamento (4-5%) pH 6.8 é usado embalar dentro proteínas junto após o carregamento

- a polimerização dos gels é aumentada pelos catalizadores APS e TEMED que se apressam acima da reação da polimerização (formação e solidification) do gel de poly-acrylamide.

- carregue cada amostra com cuidado e para impedir lentamente a amostra que escapa fora da pista.

- carregue cada pista e use o amortecedor da amostra em cada um (para impedir dentro diferenças).

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Gel O Electrophoresis

1. Centrifuge amostras para 10 segundo após ferver.
2. Carregue a amostra em cada pista
3. Carregue a referência do MW
4. Funcione o gel em 100V (tensão constante) ou melhore-o mesmo em 40 miliampères (corrente constante). Preste atenção à proteína marker/ladder ou tinja a parte dianteira para que quando pare o gel. A corrente constante dá resultados melhores e mais afiados se você tiver o tempo.

- relógio para bolhas entre o vidro e sob o gel - isto significa que está trabalhando

- relógio para a migração da proteína (deve ir para baixo) - if.not você comutou as ligações e pode perder todas suas amostras!

- funcione inicialmente lentamente através do gel de empilhamento (~ 50 volts), este dá umas faixas mais afiadas.

- não funcione durante a noite

- não superaqueça o gel (isto faz com que o gel perca a rigidez, conduzindo aos pobres que resoloving e às faixas mal dadas forma blurry)

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Tranfer das proteínas à membrana para borrar ocidental

Selecione O Tipo Da Membrana:

Pode usar qualquer um:

- membrana de PVDF para borrões ocidentais

- membrana do nitrocellulose para borrões ocidentais

- membrana de nylon (usada raramente agora - pode rasgar)

 

Pontas para Transfering à membrana ocidental:

- luvas do desgaste em todas as vezes! Use o forceps

- minimize touching/forceps à membrana

 

Ordem de transferência Bio-Bio-RAD:

(-)
esponja no preto
papel de filtro
nitrocellulose do gel
papel de filtro
esponja
(+)

Transferência :

- mantenha fresco em 4C

- transferência durante a noite em 35 V

- pode transferir rapidamente em 1 hora em um V mais elevado

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Borrão Ocidental

A obstrução das membranas permite que você maximize a relação de signal:noise

- luvas do desgaste

- bloco com 5% Blotto (leite seco non-fat - pó) ou 1 - 5% BSA (albumina do serum de Bovídeos) para proteínas phosphorylated.

- o amortecedor é TBST

Lavagem Após A Obstrução

- lavar-se após ter obstruído etapas não é crítico, porque bloco dos povos frequentemente durante incubations preliminares do antibody.

- a lavagem é feita geralmente com amortecedor de TBST. Pode ser feito rapidamente com um volume grande de TBST.

Incubation com antibody preliminar

- rato, coelho ou a outra espécie

- geralmente 1: diluição 1000 com TBST

- se as faixas non-specific elevadas de background/many forem um problema, os incubations podem ser feitos com 5% BSA ou leite.

Lavagem após o antibody preliminar

- não assim crítico

- pode lavar-se rapidamente com volumes grandes de TBST

Incubation do antibody secundário

- 1 geralmente diluído: 10. 000 com TBST

- anti-rato, anti-coelho, ou o outro antibody conjugated com o enzyme de HRP para a deteção

Lavagem Após O Antibody Secundário

- CRÍTICO

- lavagem 5 X por 5 minutos com TBST.

- se você realmente dever se apressar, para lavar ao menos 3 vezes com volumes maiores de TBST.

Assaying para resultados

- o ECL (chemiluminescence realçado) é usado geralmente

- a película é exposta e desenvolvida. A exposição por 10 segundos é geralmente bastante para a proteína total. Os phospho-proteins podem reque 2 - 20 exposições minuciosas.

- a película é geralmente XOMAT ou película ' rápida ' similar

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Veja O Borrão Ocidental De Pesquisa de defeitos

Termos usados em borrar ocidental:

WB - borrão ocidental

IB - immunoblot (um outro termo para borrar ocidental)

Sds - sulfate dodecyl de sodium (um detergente usado em muitas soluções borrando ocidentais)

PÁGINA - Electrophoresis Do Gel De Polyacrilamide

Ab - antibody (os antibodies são usados detectar sua proteína do interesse)

HRP - Peroxidase Do Radish De Cavalo

Luminol - carcaça que HRP cleaves para causar a formação clara

Ecl - chemiluminescence realçado (solução ocidental do borrão de que realça a formação clara HRP + Luminol)

kD/kDa - kilodalton (a maioria de média das proteínas entre o kDa 30 - 80)

RAM - anti-rato Ig do coelho

Isotype do antibody de Ig - de Immunoglobulin(an)

NP-40 - Nonidet P-40

PMSF - fluoreto do phenylmethylsulfonyl

BSA - Albumina Do Serum De Bovídeos

NFDM - leite seco non-fat

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