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Borrões Ocidentais De Pesquisa de defeitos

  A guia molecular da estação aos problemas e às soluções borrando ocidentais: Problemas e soluções ocidentais comuns do borrão para eles!

Contate-nos por favor com suas idéias se você puder adicionar a esta guia.

 

Que é seu problema ocidental do borrão? - Organizado Alfabeticamente

Faixas Fuzzy

Sinal Baixo

A membrana está incandescendo no quarto escuro

Fundo Elevado

Pontos na película

Demasiado muitas faixas no borrão ocidental

Sinal Fraco

 

 

Problema Ocidental De Pesquisa de defeitos Dos Borrões:

Pontos na película (faixas faltando) :

- transferência dos pobres devido às bolhas de ar durante transferência à membrana

- película suja ao adicionar ao colaborador

- os rolos de colaborador estão sujos

Solução aos pontos na película:

- use uma pipeta do pasteur como um rolo do rolo a membrana e o gel antes de transferência remover a membrana e os materiais do sustento das bolhas molhados.

- mantenha a película limpa antes de adicionar ao colaborador

 

Problema Ocidental De Pesquisa de defeitos Dos Borrões:

Demasiado muitas faixas no borrão ocidental:

- geralmente devido a muitas faixas non-specific

- qualidade preliminar deficiente do antibody ou antibody velho

- não bastante obstruindo

- cleavage proteolytic do antígeno - todas as faixas adicionais são um MW mais baixo do que sua proteína, (o IE sua proteína está sendo detectado mas foi degradado)

Soluções demasiado a muitas faixas no borrão ocidental:

- compre um outro antibody ou substitua-o com um estoque fresco do antibody

- bloco com leite non-fat seco de 5% ou BSA antes da adição preliminar. Se você estiver obstruindo já, considere obstruir durante incubations preliminares e secundários do antibody e também aumentar obstruindo o leite ou a concentração de BSA.

- mantenha tudo no gelo, use amostras frescas, armazene dentro - 80C, e use inibidores do protease tais como PMSF

 

Problema Ocidental De Pesquisa de defeitos Dos Borrões:

Fundo elevado; sinal baixo à relação de ruído no borrão ocidental

- preto ou cada película escura; a película era demasiado longa exposto

- obstruir era insuficiente; o emperramento non-specific do antibody preliminar e os antibodies secundários não foram lavados completamente

- a lavagem era insuficiente

- a película incandesce na obscuridade! - diluições secundárias ou preliminares demasiado elevadas

Soluções à película escura:

- exposição por menos tempo, tempo da exposição da diminuição

- aumente a obstrução da duração do incubation seco non-fat do leite 5% ou aumente a concentração.

- também você pode tentar obstruir com o serum inteiro do animal do anfitrião com (ou antes) o antibody secundário

- aumente épocas de lavagem e os volumes à ajuda removem todo o sinal non-specific devido ao emperramento fraco do antibody.

- usar um detergente mais forte lavar-se - em vez de TBST (Tween-20), usar uns detergentes mais fortes tais como NP-40 ou SDS que podem fornecer uma lavagem mais estrita e reduzir o fundo (faz este somente se você se une é forte! - lavar-se também remove alguma sua faixa do interesse!)

- concentração secundária muito elevada do antibody (ou mesmo preliminar) - execute experiências do optimization para determinar diluições apropriadas do antibody diluem os antibodies mais mais.

 

Problema Ocidental De Pesquisa de defeitos Dos Borrões:

Sinal baixo ou sinal fraco

- devido a não bastante proteína carregou no gel

- o antibody preliminar é velho ou nao bom

- os phospho-proteins necessitam geralmente o incubation preliminar de noite do antibody

- não bastante antibody secundário

- sobre-obstruindo

- os reagents tornando-se são maus/você fizeram um erro ao prepará-los

Soluções ao sinal baixo ou ao sinal fraco:

- carregue mais amostra da proteína no gel

- antibody preliminar fresco da tentativa

- incubate o overnite preliminar do antibody para phosphoproteins em 4 graus de C (shaker do quarto frio)

- aumente a concentração da proteína (lyse amostras em menos amortecedor do lysis)

- diminua a concentração do agente de obstrução

- verifique os reagents tornando-se; prepare o ECL fresco e o re-ECL a membrana

- aumente a concentração ou o comprimento do período preliminar do incubation do antibody

- aumente a concentração ou o comprimento do período secundário do incubation do antibody

 

Faixas fuzzy, faixas manchadas, faixas nao afiadas

- manchado faixas devido ao gel quente

- fuzzy das faixas devido à alta tensão

Soluções às faixas fuzzy e às faixas un-sharp:

- diminua a tensão ou atual, funcione-a no quarto frio, e prepare-a o amortecedor running novo (o calor faz com que o gel perca sua rigidez e sua potência resolvendo)

- pre-embeba a membrana de transferência na solução apropriada de transferência (determinada pelo fabricante da membrana) para o comprimento de tempo requerido.