Borrões ocidentais de pesquisa de defeitos

- Transferência dos pobres devido às bolhas de ar durante transferência à membrana

- película suja ao adicionar ao colaborador

- os rolos de colaborador estão sujos

Solução aos pontos na película:

- use uma pipeta do pasteur como um rolo. role a membrana e o gel antes de transferência para remover as bolhas. mantenha a membrana e os materiais molhados.

- mantenha a película limpa antes de adicionar ao colaborador

Problema ocidental de pesquisa de defeitos dos borrões:

- geralmente devido a muitas faixas não específicas

- qualidade preliminar deficiente do anticorpo ou anticorpo velho

- não bastante obstruindo

- segmentação proteolytic do antígeno - todas as faixas adicionais são um mais baixo MW do que sua proteína, (o IE sua proteína está sendo detectado mas foi degradado)

Soluções a faixas demais no borrão ocidental:

- compre um outro anticorpo ou substitua-o com um estoque fresco do anticorpo

- bloco com leite non-fat seco de 5% ou BSA antes da adição preliminar. Se você já está obstruindo, considere obstruir durante incubação preliminares e secundárias do anticorpo e igualmente aumentar obstruindo o leite ou a concentração de BSA.

- mantenha tudo no gelo, use amostras frescas, armazene dentro - 80C, e use inibidores de protease tais como PMSF

Problema ocidental de pesquisa de defeitos dos borrões:

- preto ou cada película escura; a película foi expor demasiado por muito tempo

- obstruir era insuficiente; o emperramento não específico do anticorpo preliminar e os anticorpos secundários não foram lavados completamente

- a lavagem era insuficiente

- a película incandesce na obscuridade! - diluições secundárias ou preliminares demasiado elevadas

Soluções à película escura:

- exposição por menos tempo, tempo de exposição da diminuição

- aumente a obstrução da duração da incubação non-fat do leite seco 5% ou aumente a concentração.

- igualmente você pode tentar obstruir com o soro inteiro do animal do anfitrião com (ou antes) o anticorpo secundário

- aumente épocas e volumes de lavagem ajudar a remover todo o sinal não específico devido ao emperramento fraco do anticorpo.

- usar um detergente mais forte para lavar - em vez de TBST (Tween-20), para usar uns detergentes mais fortes tais como NP-40 ou SDS que podem fornecer uma lavagem mais estrita e reduzir o fundo (faz esta somente se você se une é forte! - lavar igualmente remove alguma sua faixa do interesse!)

- concentração secundária muito elevada do anticorpo (ou mesmo o preliminar) - execute experiências da optimização para determinar diluições apropriadas do anticorpo. dilua os anticorpos mais adicionais.

Problema ocidental de pesquisa de defeitos dos borrões:

- devido a não bastante proteína carregou no gel

- o anticorpo preliminar é velho ou nao bom

- os phospho-proteins precisam geralmente a incubação preliminar de noite do anticorpo

- não bastante anticorpo secundário

- sobre-obstruindo

- os reagentes tornando-se são ruins/você fizeram um erro ao prepará-los

Soluções ao baixo sinal ou ao sinal fraco:

- carregue mais amostra da proteína no gel

- anticorpo preliminar fresco da tentativa

- incube o overnite preliminar do anticorpo para phosphoproteins em 4 graus de C (o abanador de quarto frio)

- aumente a concentração de proteína (lyse amostras em menos amortecedor do lysis)

- diminua a concentração de agente de obstrução

- verific os reagentes tornando-se; prepare o ECL e o re-ECL frescos a membrana

- aumente a concentração ou o comprimento do período de incubação preliminar do anticorpo

- aumente a concentração ou o comprimento do período de incubação secundário do anticorpo

- manchado faixas devido ao gel quente

- distorcido das faixas devido à alta tensão

Soluções às faixas distorcido e às faixas Un-sharp:

- diminua a tensão ou atual, funcione-a no quarto frio, e prepare-a o amortecedor running novo. (o calor faz com que o gel perca sua rigidez e sua potência de resolução)

- pre-embeba a membrana de transferência na solução apropriada de transferência (determinada pelo fabricante da membrana) para a duração exigida.