Borrão ocidental

 

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Protocolo de mancha ocidental

Ocidental-borre o protocolo

Preparação das amostras para a electroforese do gel de SDS-PAGE da pilha preparada Lysates

1. Prepare geles para SDS-PAGE
2. Prepare o amortecedor 1X running
3. Adicione 50 mL do beta-mercaptoethanol ao amortecedor da amostra de 950 ml (para 1 mL). (somente se você pre-não adicionou o beta-mercaptoethanol ao amortecedor da amostra)
4. Adicione o amortecedor da amostra a cada amostra (predetermine quanto amostra você pode carregar por o poço - os pentes de BioRad finamente podem reter sobre 30uL. Os grandes pentes enlatam o accomate até 50uL).
5. Amostras do Vortex momentaneamente.
6. Pique um furo no tampão de cada tubo (para impedir as partes superiores estalando ao ferver)
7. Fervura no bloco/banho maria do aquecimento em (95°C) por 5 minutos (umas mais baixas temperaturas foram mostradas para impedir a agregação não específica da proteína)

Após ter fervido amostras da proteína - carregamento e corredor o gel de SDS-PAGE

1. Centrifugue amostras para 1 minuto na alta velocidade.
2. Carregue a amostra em cada pista.
3. Carregue a referência do MW (escada do peso molecular). (você pode querer
4. Funcione o gel em 100V (100V com do empilhamento do gel, a tensão pode ser aumentado até 200V ao funcionar em separar o gel com abundância de amortecedor running)

Transferência de amostras da proteína à membrana

1. Prepare o amortecedor de transferência 1X
2. Embeba e agite o gel no amortecedor de transferência para o minuto 15
3. Embeba a membrana da nitrocelulose (ou o PVDF) e o papel de filtro (extremamente grosso) por diversos minutos.
4. Coloc o sanduíche na pilha de transferência:

ESPAÇO LIVRE grosso extra do papel de filtro
Membrana
Gel
PRETO grosso extra do papel de filtro

5. Transferência elétrica: overnite 35V ou 90V para 1 hora dependendo do tamanho de sua proteína ou de sua paciência!

Protocolo de mancha ocidental ou Immunoblotting

1. Prepare 1X TBST das soluções conservadas em estoque.
2. Prepare a obstrução do amortecedor (albumina de soro bovino de 3% ou leite da Borrar-classe de 5% (mamado) em TBST). (você pode querer tentar diversas vezes e circunstâncias de obstrução diferentes).
3. Lave a membrana em 1X TBST com agitação por 10 Min.
4. Bloco na temperatura ambiente para 1 hora com obstrução do amortecedor (agitação ou rotator circular)
5. Incube sua membrana (PVDF ou nitrocelulose) com o anticorpo preliminar de 1° Ab durante a noite (para a mancha difícil condiciona o phosphorylation do IE das proteínas) ou 1 hora para (condições fáceis tais como a proteína total) em 4°C (overnite) ou em temperatura ambiente (uma incubação de 1 hora somente) coberta com o envoltório de saran (agitação delicada). Você pode usar cubas plásticas da loja do dólar para esta (use estes somente borrando!) ou partes inferiores da caixa da pipeta do uso. A diluição para o anticorpo preliminar é em torno do 1:1000. Veja instruções do fabricante.
6. Lave com 1X TBST 3 x o minuto 15
7. Incube sua membrana (PVDF ou nitrocelulose) com anticorpo secundário, 2° Ab para 30 - 45 mínimos ou (1 hora - para circunstâncias de mancha difíceis) na temperatura ambiente. A diluição para anticorpos secundários é geralmente 1:10,000 ou mais altamente. (IE 1uL de secundário em 10mL de TBST por a membrana) veja instruções do fabricante.  Você pode querer adicionar seu anticorpo a obstruir a solução para diminuir o emperramento não específico especial se você começ o fundo elevado em sua primeira experiência.
8. Lavagem com TBST   4-5 x 10 Min. Esta é a etapa de lavagem a mais importante.
9. ECL (5min)
10. Exposição à película. Geralmente o tempo de exposição de borrões ocidentais é aproximadamente 10-30 segundos. Mais por muito tempo (5-10 minutos) para o phosphorylation. Se você tem um sinal realmente fraco, você precisam de carregar mais proteína ou a tentativa para aumentar o tempo de exposição (até 30 minutos - você pode tentar deixá-la em uma gaveta mais longa).
11. Mantenha sua membrana! Você pode manter sua membrana em TBST 1X no refrigerador por um quando. Você pode precisá-lo para as seguintes razões: 1) que verific o carregamento (os revisores de papel podem pedir a proteína total ou um padrão do carregamento tal como o actínio). Também, você pode sondar inicialmente para um phospho-protein e então descascar e o reprobe para a proteína total.

Igualmente veja nosso protocolo de descascamento de mancha ocidental da membrana