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Protocolo Borrando Ocidental

Ocidental-borre o protocolo

Preparação das amostras para o electrophoresis do gel de SDS-PAGE da pilha preparada Lysates

1. Prepare gels para SDS-PAGE
2. Prepare amortecedor running do 1X
3. Adicione 50 mL do beta-beta-mercaptoethanol ao amortecedor da amostra de 950 ml (para 1 mL). (somente se você pre-não adicionou o beta-beta-mercaptoethanol ao amortecedor da amostra)
4. Adicione o amortecedor da amostra a cada amostra (pre-determine quanto amostra você pode carregar por o poço - os combs de BioRad finamente podem reter sobre 30uL. Os combs grandes enlatam o accomate até 50uL).
5. Amostras do vortex momentaneamente.
6. Pique um furo no tampão de cada tubo (para impedir os altos estalando ao ferver)
7. Fervura no banho do heating block/water em (95°C) por 5 minutos (umas temperaturas mais baixas foram mostradas para impedir o aggregation non-specific da proteína)

Após ter fervido amostras da proteína - carregamento e corredor o gel de SDS-PAGE

1. Centrifuge amostras para 1 minuto na alta velocidade.
2. Carregue a amostra em cada pista.
3. Carregue a referência do MW (escada do peso molecular) (você pode querer
4. Funcione o gel em 100V (100V com do empilhamento do gel, tensão pode ser aumentado até 200V ao funcionar em separar o gel com abundância de amortecedor running)

Transferência de amostras da proteína à membrana

1. Prepare o amortecedor de transferência do 1X
2. Embeba e agite o gel no amortecedor de transferência por 15 minutos
3. Embeba a membrana do nitrocellulose (ou o PVDF) e o papel de filtro (extremamente grosso) por diversos minutos.
4. Coloque o sanduíche na pilha de transferência:

ESPAÇO LIVRE grosso extra do papel de filtro
Membrana
Gel
PRETO grosso extra do papel de filtro

5. Transferência elétrica: overnite 35V ou 90V para 1 hora dependendo do tamanho de sua proteína ou de sua paciência!

Protocolo borrando ocidental ou Immunoblotting

1. Prepare o 1X TBST das soluções conservadas em estoque.
2. Prepare a obstrução do amortecedor (albumina do serum de Bovídeos de 3% ou leite da Borr-classe de 5% (Blotto) em TBST). (você pode querer tentar diversas vezes e circunstâncias de obstrução diferentes).
3. Lave a membrana no 1X TBST com agitação por 10 minutos.
4. Bloco na temperatura de quarto para 1 hora com obstrução do amortecedor (agitação ou rotator circular)
5. Incubate sua membrana (PVDF ou nitrocellulose) com o antibody preliminar de 1° Ab durante a noite (para borrar difícil condiciona o phosphorylation do IE das proteínas) ou 1 hora para (condições fáceis tais como a proteína total) em 4°C (overnite) ou em temperatura de quarto (um incubation de 1 hora somente) coberta com o envoltório de saran (agitação delicada). Você pode usar tubs plásticos da loja do dólar para este (use estes somente borrando!) ou fundos da caixa da pipeta do uso. A diluição para o antibody preliminar é ao redor 1:1000. Veja instruções do fabricante.
6. Lave com 1X TBST  3 x 15 minutos
7. Incubate sua membrana (PVDF ou nitrocellulose) com antibody secundário, 2° Ab por 30 – 45 minutos ou (1 hora - para circunstâncias borrando difíceis) na temperatura de quarto. A diluição para antibodies secundários é geralmente 1:10,000 ou mais elevada. (IE 1uL de secundário em 10mL de TBST por a membrana) veja instruções do fabricante.  Você pode querer adicionar seu antibody a obstruir a solução para diminuir o emperramento non-specific especial se você começou o fundo elevado em sua primeira experiência.
8. Lavagem com TBST   4-5 x 10 minutos. Esta é a etapa de lavagem a mais importante.
9. Ecl (5min)
10. Exposição à película. Geralmente o tempo da exposição de borrões ocidentais é aproximadamente 10-30 segundos. Mais por muito tempo (5-10 minutos) para o phosphorylation. Se você tiver um sinal realmente fraco, você necessitam carregar mais proteína ou a tentativa para aumentar o tempo da exposição (até 30 minutos - você pode tentar deixá-la em um casette mais longa).
11. Mantenha sua membrana! Você pode manter sua membrana no 1X de TBST no refrigerador por um quando. Você pode necessitá-lo para as seguintes razões: 1) verificando o carregamento (os revisores de papel podem pedir proteína total ou um padrão do carregamento tal como o actin). Também, você pode sondar inicialmente para um phospho-protein e então descascar e o reprobe para a proteína total.

Veja também nosso protocolo descascando borrando ocidental da membrana