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Determinação da proteína pelo protocolo do absorption de UV

Determinação da proteína pelo protocolo do absorption de UV, (modificado do protocolo por Alastair Aitken e por Michèle P. Learmonth)

Materiais para a concentração UV da proteína

1. 0.1 M K2SO4 (pH 7.0).
2. amortecedor de phosphate do potassium de 5 milímetros, pH 7.0.
3. Detergente nonionic (0.01% Brij 35)
4. Guanidinium-HCl.
5. filtro do millipore de 0.2-µm (Watford, Reino Unido).
6. spectrometer UV-visível: A lâmpada do hidrogênio deve ser selecionada para a intensidade     máxima
no wavelength particular.
7. Cuvets, quartzo, para < 215 nm.

Método UV Da Concentração Da Proteína

 Estimation da proteína pelo absorbance de Próximo UV (280 nm):

1. Um spectrophotometer de confiança é necessário. A solução da proteína deve ser diluída no
o amortecedor a uma concentração que esteja bem dentro da escala exata do instrumento (vê as notas 1 e 2).

2. A solução da proteína a ser medida pode estar em uma escala larga dos amortecedores, assim que não é geralmente nenhum problema para encontrar um que é apropriado para a proteína que pode já estar em um amortecedor particular requerido para uma etapa ou um assay do purification para a atividade de enzyme, porque o exemplo (veja as notas 3 e 4).

3. Meça o absorbance da solução da proteína em 280 nm, usando os cuvets de quartzo ou os cuvets que são sabidos para ser transparentes a este wavelength, enchidos com um volume da solução suficiente cobrir a abertura através de que o feixe luminoso passa.

4. O valor obtido dependerá do comprimento de trajeto do cuvet. If.not 1 cm, deve ser
ajustado pelo fator apropriado. A lei da Cerveja-Lambert indica aquela: A (absorbance) = ε c l onde ε = o coeficiente da extinção, c = a concentração no mol/L e l = comprimento de trajeto ótico no cm. conseqüentemente, se ε for sabido, medida de A dão a concentração diretamente, ε está
citado normalmente para um comprimento de trajeto 11-cm.

5. O valor real do absorbance UV para uma proteína dada deve ser determinado por algum método absoluto, por exemplo, calculado da composição de amino-ácido, que pode ser determinada pela análise do amino-ácido. O absorbance UV para uma proteína é calculado então de acordo com a seguinte fórmula: A280 (1 mg/mL) = (5690nw + 1280ny + 120nc)/M
de onde o nanowatt, ny, e o nc são os números de resíduos de Trp, de Tyr, e de Cys no polypeptide
a massa M e 5690, 1280 e 120 é os coeficientes respectivos da extinção para estes resíduos (veja a nota 5).

Veja também protocolos da concentração da proteína de outros laboratórios.

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