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Protocolo Do Assay Da Proteína De Lowry

Determinação da concentração da proteína pelo protocolo do assay de Lowry Prtoein

Materiais

1. Complexo-dando forma ao reagent: Prepare imediatamente antes do uso misturando as seguintes soluções conservadas em estoque na proporção 100:1:1 (pelo vol), respectivamente:
            Solução A: 2% (w/v) Na2CO3 na água destilada.
            Solução B: 1% (w/v) CuSO4·5H2O na água destilada.
            Solução C: tartrate do potassium do sodium de 2% (w/v) na água destilada.

2. Prepare O NaOH De 2 N.

3. Reagent do folin (comercialmente disponível): Uso em 1 concentração de N.

4. Padrões: Use uma solução conservada em estoque da proteína padrão (por exemplo, fração da albumina do serum de Bovídeos V) que contem a proteína de 2 mg/mL na água destilada, armazenada congelado –em 20°C. Prepare padrões diluindo a solução conservada em estoque com água destilada como segue:

Estoque a solução   (µL)     0         2.5      5          12.5     25        50        125      250      500

Água                (µL)     500      498     495      488      475      450      375      250      0
Proteína conc.    (µg/mL) 0          10       20        50        100      200      500      1000    2000

Método

1. A 0.1 mL da amostra ou padrão, adicione 0.1 mL do NaOH de 2 N. Hydrolyze em 100°C por 10 minutos em um banho do bloco do heating ou da água fervendo.

2. Refrigere o hydrolysate à temperatura de quarto e adicione 1 mL do misturado recentemente complexo-dando forma ao reagent. Deixe a solução estar na temperatura de quarto por 10 minutos.

3. Adicione 0.1 mL do reagent do folin, usando um misturador do vortex, e deixe o carrinho da mistura na temperatura de quarto por 30–60 minutos (não exceda 60 minutos).

4. Leia o absorbance em 750 nm se a concentração da proteína estiver abaixo de 500 µg/mL ou em 550 nm se a concentração da proteína estiver entre 100 e 2000 µg/mL.

5. Trace uma curva padrão do absorbance em função da concentração inicial da proteína e use-a determinar as concentrações desconhecidas da proteína.

Referências Do Método De Lowry

Baseado no protocolo por Jakob H. Waterborg.

Lowry et al. J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)

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