Imunoprecipitação

As amostras podem então ser lavadas após a precipitação e a centrifugação. Os precipitates podem então ser funcionados em geles de SDS-PAGE com amortecedor da amostra da proteína. Geralmente as amostras da proteína são radiolabeled antes do lysis da pilha. Isto é feito geralmente adicionando ácidos aminados radiolabeled às pilhas. Isto faz coisas simples enquanto a proteína está detectada então facilmente na película quando funcionada em um gel como o ponto se emitirá a película da radioactividade e da exposição. Você pode então avaliar para o tamanho da proteína (no peso molecular com a comparação para fazer sob medida padrões), e a quantidade (comparando amostras tratadas ou a um padrão das quantidades).

Além disso, o procedimento da imunoprecipitação igualmente permite a concentração de proteínas que não são muito abundantes ou difíceis de detectar usando o borrão ocidental. O IP pode concentrar proteínas até a dobra 10.000 enquanto pode tomar grandes volumes de lysates da pilha e concentrar sua proteína do interesse em um precipitate pequeno que possa então ser usado para a análise ocidental do borrão ou os outros métodos.

Aplicações da imunoprecipitação:

1) Determinação do peso molecular e da quantidade de proteína immunoprecipitated por SDS-PAGE.

2) A imunoprecipitação é usada para avaliar para interações da proteína-proteína. Isto é feito a imunoprecipitação para uma proteína, e então pela mancha para uma outra proteína.

3) Quantificação da taxa de síntese de uma proteína nas pilhas determinando a proteína radiolabeled da quantidade feita durante uma quantidade de tempo específica.

4) A imunoprecipitação permite à concentração de proteínas que são de outra maneira difíceis de detectar.

O método da imunoprecipitação pode ser dividido em diversas etapas:

Dependendo da aplicação da imunoprecipitação ou do IP, você quererá usar amortecedores diferentes do lysis.  A escolha do amortecedor do lysis é importante e é dependente das características da proteína do interesse.

Se queira estudar o phosphorylation das proteínas ou das interações da proteína-proteína, você deve tentar Np-40.

Se você está estudando níveis da proteína total de uma proteína, você deve tentar RIPA.

• Tris-HCl de 50 milímetros
• Ajuste ao pH 7.4
• 150 milímetros de NaCl
• 1 milímetro PMSF
• o EDTA de 1 milímetro
• 5 µg/ml Aprotinin
• 5 µg/ml Leupeptin
• 1% Triton x-100
• Deoxycholate do sódio de 1%
• 0.1% SDS

• 50 do Tris-HCl milímetros de concentração do final
• 150 do NaCl milímetros de concentração do final
• Adicione 1% NP-40
• Ajuste ao pH 8.0

A etapa preclear é executada geralmente para a imunoprecipitação porque abaixa a quantidade de proteínas não específicas no lysate da pilha. Além disso, o pre-esclarecimento igualmente remove as proteínas que podem ter interações não específicas possíveis e uma afinidade elevada para a proteína A, proteína G, Immunoprecipitin, Zysorbin, ou os o que formulário insolúvel de proteína obrigatória do anticorpo você está usando a pull-down seu anticorpo. Alguns investigadores encontram esta etapa desnecessária e saltam esta etapa. Pre-esclarecimento da tentativa a primeira vez que você tenta a imunoprecipitação. Se seus resultados são completamente desobstruídos, tente saltar a experiência seguinte do pre-esclarecimento e veja como despeja.

Que anticorpo deve você usar para a imunoprecipitação? Os anticorpos geralmente Polyclonal são usados para o immunoprecipation.

Os complexos do anticorpo-antígeno não são insolúveis sós, IE. a imunoprecipitação, não é uma idéia completa. Os anticorpos e seu emperramento aos antígenos são solúveis no sangue, amortecedores, e durante a experiência da imunoprecipitação.  O que é usado para precipitar para fora estes complexos é proteínas obrigatórias do anticorpo insolúvel. As proteínas A e G, foram isoladas das bactérias, e do ligamento à região constante do anticorpo.

Os exemplos das proteínas obrigatórias do anticorpo insolúvel usadas para precipitar complexos na imunoprecipitação são:

• Proteína A
• Proteína G
• Zysorbin
• Immunoprecipitin

  Lavar os complexos é feito usando RIPA, PBS, IP-lava o amortecedor, ou os outros amortecedores dependendo do que você gostaria de analisar após o IP. O amortecedor de RIPA é mais estrito visto que PBS é menos estrito.

Receita do amortecedor da lavagem do IP

• 10mM Tris; Ajuste ao pH 7.4
• o EDTA de 1mM
• 1mM EGTA; pH 8.0
• NaCl de 150mM
• 1% Triton X-100
• ortho-vanadate do sódio de 0.2mM
• cocktail do inibidor de protease

Notas finais para a imunoprecipitação

  O sucesso da imunoprecipitação é dependente da afinidade do anticorpo para seu antígeno.  Um bom anticorpo da imunoprecipitação dar-lhe-á o baixo fundo quando você analisa as amostras usando outras técnicas após o IP.  As proteínas anticorpo-obrigatórias insolúveis usadas são igualmente muito importantes. Os anticorpos Polyclonal são os melhores anticorpos para usar anticorpos monoclonais entretanto purified podem igualmente ser usados.  Verific seu vendedor do anticorpo para ver se seu anticorpo monoclonal foi testado para a imunoprecipitação.

Pontas para a imunoprecipitação

• Use os tubos de 2 mL para a imunoprecipitação como precipitates mais facilmente são lavados e resuspended
• Tente saltar a etapa do pre-esclarecimento para ganhar o tempo
• Em vez do lavagem com IP-lave a tentativa PBS do amortecedor
• Se você já tem o baixo fundo e seu anticorpo é grande, tente o IP que lava 2X em vez de 5X
• Certifique-se de você remover tanto líquido dos tubos do eppendorf quando lavagem da imunoprecipitação