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Protocolo Do Immunoprecipitation

Immunoprecipitation e protocolos.

IP Básico Do Protocolo Do Immunoprecipitation:

1. Trate suas pilhas

2. Colha pilhas adicionando 500 uL de solubilizing o amortecedor, raspe-as e passe-as através do syringe 21-gauge tempos da agulha um X5 homogenize.

3. Conduza uma precipitação do TCA (isto será usado normalizar se você radiolabeled as pilhas por exemplo com S-35)

4. Pre-pre-clearing: Pre-desobstruído adicionando 2 uL de X, rato ou coelho ou serum da cabra (onde X é a espécie animal em que o antibody preliminar foi levantado) às amostras inteiras e incubate em um rotator por 30 minutos na temperatura de quarto.

5. Remova o serum de X incubating com o immunoprecipitin de 30 uL com uma rotação de 30 minutos na temperatura de quarto.

6. Centrifuge amostras por 3 minutos em 13, 000 RPM.

7. Após o centrifugation, adicione 5 uL do antibody preliminar (proteína específica anti-Y de X, onde Y é o antibody levantado em um animal para sua proteína do interesse) aos supernatants e incubate durante a noite em 4 graus de C.

8. Adicione 100 uL do immunoprecipitin às amostras. Alternativamente você pode usar Zysorbin (Invitrogen). (Zysorbin requer algumas mudanças menores ao protocolo)

9. Centrifugador em 13, 000 RPM por 3 minutos. Remova o supernatant.

10. Lave a pelota 3 X com 1 mL do amortecedor frio da lavagem do IP (adicione inibidores do protease ao amortecedor do wah antes do uso) com agitação por 5-10 minutos entre cada lavagem.

11. Use esta pelota funcionar em um gel de SDS-PAGE. Você pode adicionar o amortecedor da amostra do SDS (amortecedor do carregamento da proteína) ao este e a carga no gel diretamente após ferver.

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