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1. Reagent: O reagent do assay é feito dissolvendo magnésio 100 de Coomassie G250 azul em 50 mL do ethanol de 95%. A solução então é misturada com os 100 mL do ácido phosphoric de 85% e composta a 1 litro com água destilada. O reagent deve ser filtrado através do papel de filtro de Whatman no. 1 e então ser armazenado em um frasco ambarino na temperatura de quarto. É estável por diversas semanas. Entretanto, durante este tempo a tintura pode precipitate da solução e assim que o reagent armazenado deve ser filtrado antes do uso.
2. Padrão da proteína. Bovídeos γ- o globulin em uma concentração de 1 mg/mL (100 µg/mL para o microassay) na água destilada é usado como uma solução conservada em estoque. Isto deve ser armazenado congelado –em 20oC. Desde que o índice de umidade da proteína contínua pode variar durante o armazenamento, a concentração precisa da proteína na solução padrão deve ser determinada de seu absorbance em 280 nm. O absorbance de uma 1 solução de mg/mL de γ- o globulin, em um trajeto 11-cm claro, é 1.35. Os valores correspondentes para dois padrões da proteína, albuminas do serum de Bovídeos e ovalbumin alternativos, são 0.66 e 0.75, respectivamente.
3. O plástico e o glassware usados no assay devem ser absolutamente limpos e detergente livre. Os cuvettes do spectrophotometer de quartzo (silicone) não devem ser usados, porque a tintura liga a este material. Os traços do limite da tintura ao glassware ou ao plástico podem ser removidos enxaguando com o metanol ou a solução detergente.
1. Introduza com pipeta entre o µg 10 e 100 da proteína no volume total de 100 µL em um tubo de teste. Se a concentração aproximada da amostra for desconhecida, assay uma escala das diluições (1, 1:10, 1:100, 1:1000). Prepare duplicatas de cada amostra.
2. Para a curva de calibração, introduza com pipeta volumes duplicados 10, 20, 40, 60, 80, e 100 do µL de 1 mg/mL γ- solução padrão do globulin nos tubos de teste, e faça a cada um até 100 µL com água destilada. Introduza com pipeta o µL 100 da água destilada em um tubo mais adicional para fornecer o espaço em branco do reagent.
3. Adicione 5 mL do reagent da proteína a cada tubo e misture-os bem pelo inversion ou dome-os vortexmixing. Evite de espumar, que conduzirá ao reproducibility deficiente.
4. Meça o A595 das amostras e dos padrões de encontro ao espaço em branco do reagent entre 2 minutos e 1 h após misturar. O padrão de 100 µg deve dar um valor A595 de aproximadamente 0.4. A curva padrão não é linear, e o absorbance preciso varia dependendo da idade do reagent do assay. Conseqüentemente, é essencial construir uma curva de calibração para cada jogo dos assays.
O método do microassay este formulário do assay é mais sensível à proteína. Conseqüentemente, é útil quando a quantidade da proteína desconhecida é limitada (veja também a nota 9). 1. Introduza com pipeta as amostras duplicadas que contêm entre o µg 1 e 10 em um volume total do µL 100 nos tubos do microfuge do polietileno 1.5-mL. Se a concentração aproximada da amostra for desconhecida, assay uma escala das diluições (1, 1:10, 1:100, 1:1000).
2. Para a curva de calibração, introduza com pipeta volumes duplicados 10, 20, 40, 60, 80, e 100 do µL de 100 µg/mL γ- solução padrão do globulin nos tubos do microfuge, e ajuste o volume ao µL 100 com água. Introduza com pipeta o µL 100 da água destilada em um tubo para o espaço em branco do reagent.
3. Adicione 1 mL do reagent da proteína a cada tubo e misture-o delicadamente, mas completamente.
4. Meça o absorbance de cada amostra entre 2 e 60 minutos após a adição do reagent da proteína. O valor A595 de uma amostra que contem o µg 10 γ- o globulin é 0.45.
veja também: Assay Da Proteína De Bradford
Modificado do protocolo por Nicholas J. Kruger.
Protocolo Da Concentração Da Proteína
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