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Proteína e antibody Microarrays
Métodos de deteção e emperramento
non-specific
O emperramento non-specific à disposição
necessita ser minimizado e este é feito tipicamente immersing as
disposições em um amortecedor baseado albumina do serum de Bovídeos
(BSA) (31).
Analyte-ligar e retenção em disposições da proteína
proseguem através do mecanismo obrigatório thermodynamically
dirigido similar ao hybridization de alvos do ácido nucleic às
pontas de prova. Entretanto, a deteção de alvos
encadernados às proteínas é consideravelmente mais complexa do que
aquela da deteção microarray do DNA (9). Uma variedade
de métodos de deteção está sendo examinada atualmente. Para o exemplo, ELISA foi usado primeiramente detectar
proteínas para disposições do filtro (66.67) e disposições do
vidro (68). Os métodos de deteção baseados ELISA têm
a desvantagem do non-non-specificity de interações do
proteína-protein-antibody, conduzindo a muitos positivos falsos. Etiquetar do radioisotope foi usado por Ge et por al. (22), radioisotope que
etiqueta para estudar a proteína–da proteína, DNA–da proteína, interações–da droga da
proteína em disposições do filtro. Zhu et al. radioisotope usado que etiqueta
para conduzir assays do kinase de carcaças diferentes usando
proteínas purified do kinase do fermento em uma disposição (36). O método preferido da deteção é deteção do
fluorescence porque estes métodos são geralmente seguros,
extremamente sensível, simples e pode ter muito de alta resolução. Estes métodos de deteção são também compatíveis com
os varredores microarray padrão. Geralmente, uma microplaqueta
é qualquer uma sondada diretamente com uma molécula fluorescente
(por exemplo uma proteína fluorescently etiquetada ou uma molécula
pequena, usando uma ponta de prova etiquetada (por exemplo biotin),
que possa então ser detectada em uma segunda etapa usando um reagent
fluorescently etiquetado da afinidade (por exemplo streptavidin)
(16.56). Um outro método etiquetando fluorescente é o
amplification do círculo do rolling (RCA), que é também
extremamente sensível (32).
Embora os proteomes sob a comparação possam ser etiquetados em
uma forma comparável com fluorophores, o reproducibility destas
reações químicas é deficiente e interferência com os presentes
das interações do proteína-protein-antibody uma complexidade
adicional (9). Também, etiquetar non-uniform das proteínas
pode ser dirigido executando um assay ratiometric da duplo-cor, onde
um padrão interno esteja atual para cada proteína do alvo que é
medida (9). Uma desvantagem de proteínas etiquetando com
fluorophores é uma redução da exatidão quantitative do assay,
porque a incorporação da etiqueta pode alterar as propriedades
obrigatórias das proteínas (9).
Embora os métodos de deteção etiquetando da proteína
direta fossem usados ainda extensamente, os problemas intrínsecos
mencionados resultaram no uso crescente de métodos de deteção da
etiqueta livre para microarrays da proteína. Estes
métodos são spectrometry maciço (MS), o microscopy atômico da
força (AFM) (70), e o resonance de superfície do plasmon (SPR) (71).
os métodos Non-etiquetando têm vantagens como uma
aproximação direta da deteção para microarrays do antibody desde
que etiquetar moléculas afeta a atividade da proteína. O
spectrometry maciço de SELDI (laser superfície-realçado
desorption/ionization) foi usado detectar as disposições de baixa
densidade das proteínas capturadas (69). As proteínas são
capturadas em uma disposição da superfície do metal (disposição
da proteína de SELDI) e vaporizadas usando um feixe de laser. A análise que usa dados do spectrometry maciço é
executada então a fim revelar as identidades destas proteínas.
Mudanças topológicas da superfície atômica dos usos do
método do microscopy da força (AFM) para identificar as proteínas
capturadas em uma disposição do antibody (70). Quando o
coelho IgG immobilized em uma superfície do ouro e liga a seus
antibodies complimentary, formiga-coelho IgG da cabra, AFM detecta o
aumento na altura, e pode assim medir ligar interações. Porém a fim estudar o kinetics de interações–do antibody do antígeno, os métodos de deteção
real-time serão úteis. O resonance de superfície do
plasmon (SPR) amadureceu-se em uma ferramenta versátil da deteção
para estudar o kinetics de interações–do ligand do
receptor com uma escala larga dos pesos molecular, das afinidaoes e
das taxas obrigatórias (72-74). As microplaquetas comerciais de
SPR estão disponíveis entretanto sua definição da deteção são
limitadas. Uma superfície do sensor com os 64 locais
individuais do immobilization em uma única pilha do fluxo foi
desenvolvida (75). Um biosensor da disposição do
antibody foi desenvolvido também para estudar o kinetics do antígeno
que liga usando um waveguide planar como o método de deteção.
Usando este método, o grupo demonstrou que a intensidade
significativa do sinal poderia ser conseguida dos pontos tão pequenos
quanto 200 milímetros no diâmetro. Espera-se
conseqüentemente que esta aproximação será apropriada para o
elevado-high-throughput e estudos paralelos do kinetics. (76).
Escala da deteção
Uma outra diferença entre a proteína e os
microarrays do DNA é que as concentrações da proteína em uma
única amostra biológica ou em pilhas são diversas ordens do
magnitute mais grandes do que aquela para mRNAs. Assim
os sistemas do detetor de microplaqueta da proteína devem ter uma
escala muito grande da operação da deteção – até um
fator de 1014, comparado a 104 para o mRNA. Assim um
antibody com afinidade nanomolar a um alvo particular saturated pela
presença deste alvo em concentrações micromolar e não detectará
níveis femtomolar do pico- ou de alvo. Assim acomodar
proteínas raras e abundantes requererá provavelmente as
disposições separadas (7.8.9).
Os antibodies múltiplos com afinidaoes variando para o alvo
podem ser posicionados em áreas diferentes dos estudos da
disposição entretanto mostraram que somente 20% de antibodies postos
fornecem medidas das proteínas nas concentrações baixas (33).
Em seguida: Produção da proteína para disposições da proteína
Referências para a proteína e o antibody Microarrays
Para trás a:
Introdução e fundo às microplaquetas da proteína e às microplaquetas do antibody.
Tipos de microplaquetas do antibody e da proteína
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