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Métodos e análise de deteção de Microarray da proteína

Proteína e antibody Microarrays

Métodos e análise de deteção para microplaquetas da proteína e do antibody

Métodos de deteção e emperramento non-specific
            O emperramento non-specific à disposição necessita ser minimizado e este é feito tipicamente immersing as disposições em um amortecedor baseado albumina do serum de Bovídeos (BSA) (31).
            Analyte-ligar e retenção em disposições da proteína proseguem através do mecanismo obrigatório thermodynamically dirigido similar ao hybridization de alvos do ácido nucleic às pontas de prova.  Entretanto, a deteção de alvos encadernados às proteínas é consideravelmente mais complexa do que aquela da deteção microarray do DNA (9).  Uma variedade de métodos de deteção está sendo examinada atualmente.  Para o exemplo, ELISA foi usado primeiramente detectar proteínas para disposições do filtro (66.67) e disposições do vidro (68).  Os métodos de deteção baseados ELISA têm a desvantagem do non-non-specificity de interações do proteína-protein-antibody, conduzindo a muitos positivos falsos.   Etiquetar do radioisotope foi usado por Ge et por al. (22), radioisotope que etiqueta para estudar a proteína–da proteína, DNA–da proteína, interações–da droga da proteína em disposições do filtro.  Zhu et al. radioisotope usado que etiqueta para conduzir assays do kinase de carcaças diferentes usando proteínas purified do kinase do fermento em uma disposição (36).  O método preferido da deteção é deteção do fluorescence porque estes métodos são geralmente seguros, extremamente sensível, simples e pode ter muito de alta resolução.  Estes métodos de deteção são também compatíveis com os varredores microarray padrão. Geralmente, uma microplaqueta é qualquer uma sondada diretamente com uma molécula fluorescente (por exemplo uma proteína fluorescently etiquetada ou uma molécula pequena, usando uma ponta de prova etiquetada (por exemplo biotin), que possa então ser detectada em uma segunda etapa usando um reagent fluorescently etiquetado da afinidade (por exemplo streptavidin) (16.56). Um outro método etiquetando fluorescente é o amplification do círculo do rolling (RCA), que é também extremamente sensível (32).  
            Embora os proteomes sob a comparação possam ser etiquetados em uma forma comparável com fluorophores, o reproducibility destas reações químicas é deficiente e interferência com os presentes das interações do proteína-protein-antibody uma complexidade adicional (9). Também, etiquetar non-uniform das proteínas pode ser dirigido executando um assay ratiometric da duplo-cor, onde um padrão interno esteja atual para cada proteína do alvo que é medida (9).          Uma desvantagem de proteínas etiquetando com fluorophores é uma redução da exatidão quantitative do assay, porque a incorporação da etiqueta pode alterar as propriedades obrigatórias das proteínas (9).

Embora os métodos de deteção etiquetando da proteína direta fossem usados ainda extensamente, os problemas intrínsecos mencionados resultaram no uso crescente de métodos de deteção da etiqueta livre para microarrays da proteína.  Estes métodos são spectrometry maciço (MS), o microscopy atômico da força (AFM) (70), e o resonance de superfície do plasmon (SPR) (71). 
os métodos Non-etiquetando têm vantagens como uma aproximação direta da deteção para microarrays do antibody desde que etiquetar moléculas afeta a atividade da proteína. O spectrometry maciço de SELDI (laser superfície-realçado desorption/ionization) foi usado detectar as disposições de baixa densidade das proteínas capturadas (69). As proteínas são capturadas em uma disposição da superfície do metal (disposição da proteína de SELDI) e vaporizadas usando um feixe de laser.  A análise que usa dados do spectrometry maciço é executada então a fim revelar as identidades destas proteínas.

            Mudanças topológicas da superfície atômica dos usos do método do microscopy da força (AFM) para identificar as proteínas capturadas em uma disposição do antibody (70).  Quando o coelho IgG immobilized em uma superfície do ouro e liga a seus antibodies complimentary, formiga-coelho IgG da cabra, AFM detecta o aumento na altura, e pode assim medir ligar interações.  Porém a fim estudar o kinetics de interações–do antibody do antígeno, os métodos de deteção real-time serão úteis.  O resonance de superfície do plasmon (SPR) amadureceu-se em uma ferramenta versátil da deteção para estudar o kinetics de interações–do ligand do receptor com uma escala larga dos pesos molecular, das afinidaoes e das taxas obrigatórias (72-74). As microplaquetas comerciais de SPR estão disponíveis entretanto sua definição da deteção são limitadas.  Uma superfície do sensor com os 64 locais individuais do immobilization em uma única pilha do fluxo foi desenvolvida (75).  Um biosensor da disposição do antibody foi desenvolvido também para estudar o kinetics do antígeno que liga usando um waveguide planar como o método de deteção. Usando este método, o grupo demonstrou que a intensidade significativa do sinal poderia ser conseguida dos pontos tão pequenos quanto 200 milímetros no diâmetro. Espera-se conseqüentemente que esta aproximação será apropriada para o elevado-high-throughput e estudos paralelos do kinetics. (76).

Escala da deteção
            Uma outra diferença entre a proteína e os microarrays do DNA é que as concentrações da proteína em uma única amostra biológica ou em pilhas são diversas ordens do magnitute mais grandes do que aquela para mRNAs.  Assim os sistemas do detetor de microplaqueta da proteína devem ter uma escala muito grande da operação da deteção – até um fator de 1014, comparado a 104 para o mRNA.  Assim um antibody com afinidade nanomolar a um alvo particular saturated pela presença deste alvo em concentrações micromolar e não detectará níveis femtomolar do pico- ou de alvo.  Assim acomodar proteínas raras e abundantes requererá provavelmente as disposições separadas (7.8.9).
            Os antibodies múltiplos com afinidaoes variando para o alvo podem ser posicionados em áreas diferentes dos estudos da disposição entretanto mostraram que somente 20% de antibodies postos fornecem medidas das proteínas nas concentrações baixas (33). 

Em seguida: Produção da proteína para disposições da proteína

Referências para a proteína e o antibody Microarrays

Para trás a:

Introdução e fundo às microplaquetas da proteína e às microplaquetas do antibody.

Tipos de microplaquetas do antibody e da proteína