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Métodos e análise de deteção do Microarray da proteína

Microarrays da proteína e do anticorpo

Métodos e análise de deteção para microplaquetas da proteína e do anticorpo

Métodos de deteção e emperramento não específico
            O emperramento não específico à disposição precisa de ser minimizado e este é feito tipicamente imergindo as disposições em um amortecedor baseado da albumina de soro bovino (BSA) (31).
            a Analyte-ligação e a retenção em disposições da proteína prosiguem através do mecanismo obrigatório thermodynamically conduzido similar à hibridação de alvos do ácido nucleico às pontas de prova.  Entretanto, a deteção de alvos encadernados às proteínas é consideravelmente mais complexa do que aquela da deteção do microarray do ADN (9).  Uma variedade de métodos de deteção estão sendo examinados atualmente.  Por exemplo, ELISA foi usado primeiramente para detectar proteínas para disposições do filtro (66.67) e disposições do vidro (68).  Os métodos de deteção baseados ELISA têm a desvantagem da não-especificidade de interações do proteína-anticorpo, conduzindo a muitos positivos falsos.   A rotulagem do isótopo radioactivo foi usada pelo Ge e outros (22), isótopo radioactivo que etiqueta para estudar a proteína-proteína, proteína-ADN, interações da proteína-droga em disposições do filtro.  Zhu usou e outros o isótopo radioactivo que etiqueta para conduzir ensaios da quinase de carcaças diferentes usando proteínas purified da quinase do fermento em uma disposição (36).  O método preferido da deteção é deteção da fluorescência porque estes métodos são geralmente seguros, extremamente sensível, simples e pode ter muito a alta resolução.  Estes métodos de deteção são igualmente compatíveis com os varredores padrão do microarray. Geralmente, uma microplaqueta é qualquer uma sondada diretamente com uma molécula fluorescente (por exemplo uma proteína fluorescente etiquetada ou uma molécula pequena, usando uma ponta de prova etiquetada (por exemplo biotina), que possa então ser detectada em uma segunda etapa usando um reagente fluorescente etiquetado da afinidade (por exemplo streptavidin) (16.56). Um outro método de rotulagem fluorescente é a amplificação do círculo de rolamento (RCA), que é igualmente extremamente sensível (32).  
            Embora os proteomes sob a comparação possam ser etiquetados em uma forma comparável com fluorophores, a reprodutibilidade destas reacções químicas é deficiente e interferência com os presentes das interações do proteína-anticorpo uma complexidade adicional (9). Também, a rotulagem non-uniform das proteínas pode ser endereçada executando um ensaio ratiometric da duplo-cor, onde um padrão interno esteja atual para cada proteína do alvo que é medida (9).          Uma desvantagem de proteínas de rotulagem com fluorophores é uma redução da exatidão quantitativa do ensaio, porque a incorporação da etiqueta pode alterar as propriedades obrigatórias das proteínas (9).

Embora os métodos de deteção de rotulagem da proteína direta fossem ainda amplamente utilizados, os problemas intrínsecos mencionados conduziram ao uso crescente de métodos de deteção da etiqueta livre para microarrays da proteína.  Estes métodos são a espectrometria maciça (MS), a microscopia atômica da força (AFM) (70), e a ressonância de superfície do plasmon (SPR) (71). 
os métodos derotulagem têm vantagens como uma aproximação direta da deteção para microarrays do anticorpo desde que etiquetar moléculas afeta a atividade da proteína. A espectrometria maciça de SELDI (dessorção superfície-realçada/ionização do laser) foi usada para detectar as disposições de baixa densidade das proteínas capturadas (69). As proteínas são capturadas em uma disposição da superfície de metal (disposição da proteína de SELDI) e vaporizadas usando um raio laser.  A análise que usa dados da espectrometria maciça é executada então a fim revelar as identidades destas proteínas.

            Mudanças topológicas da superfície atômica dos usos do método da microscopia da força (AFM) para identificar as proteínas capturadas em uma disposição do anticorpo (70).  Quando o coelho IgG é imobilizado em uma superfície do ouro e liga a seus anticorpos elogiosos, formiga-coelho IgG da cabra, AFM detecta o aumento na altura, e pode assim medir ligar interações.  Porém a fim estudar a cinética de interações do antígeno-anticorpo, os métodos de deteção tempos real serão úteis.  A ressonância de superfície do plasmon (SPR) amadureceu-se em uma ferramenta versátil da deteção para estudar a cinética de interações do receptor-ligand com uma escala larga dos peso moleculares, das afinidaoes e das taxas obrigatórias (72-74). As microplaquetas comerciais de SPR estão disponíveis entretanto sua definição da deteção são limitadas.  Uma superfície do sensor com os 64 locais individuais da imobilização em uma única pilha de fluxo foi desenvolvida (75).  Um biosensor da disposição do anticorpo foi desenvolvido igualmente para estudar a cinética do antígeno que liga usando um medidor de ondas planar como o método de deteção. Usando este método, o grupo demonstrou que a intensidade significativa do sinal poderia ser conseguida dos pontos tão pequenos quanto 200 milímetros no diâmetro. Espera-se conseqüentemente que esta aproximação será apropriada para a elevado-produção e estudos paralelos da cinética. (76).

Escala de deteção
            Uma outra diferença entre a proteína e os microarrays do ADN é que as concentrações da proteína em uma única amostra biológica ou em pilhas são diversas ordens de magnitute maiores do que aquela para mRNAs.  Assim os sistemas do detetor de microplaqueta da proteína devem ter uma escala muito grande da operação da deteção - até um fator de 1014, comparado a 104 para o mRNA.  Assim um anticorpo com afinidade nanomolar a um alvo particular será saturado pela presença deste alvo em concentrações micromolar e não detectará níveis femtomolar do pico- ou de alvo.  Assim acomodar proteínas raras e abundantes exigirá provavelmente as disposições separadas (7.8.9).
            Os anticorpos múltiplos com afinidaoes de variação para o alvo podem ser posicionados em áreas diferentes dos estudos da disposição entretanto mostraram que somente 20% de anticorpos põr fornecem medidas das proteínas nas baixas concentrações (33). 

Em seguida: Produção da proteína para disposições da proteína

Referências para Microarrays da proteína e do anticorpo

De volta a:

Introdução e fundo às microplaquetas da proteína e às microplaquetas do anticorpo.

Tipos de microplaquetas do anticorpo e da proteína

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