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Condições Bem sucedidas de PCR

Parâmetros para PCR bem sucedido

Você é tido problemas de conseguir um PCR bem sucedido?  Muitos fatores podem afetar seu resultado de seu PCR como: Cofactors do íon do metal, carcaça e analogs da carcaça, amortecedores e sais e Cosolvents.  Considerações Dando um ciclo Também Térmicas:  Embarcações de PCR, optimization da temperatura e do tempo, de amplification de PCR ciclos, Enzyme/Target e começo quente. 

Cofactors do íon do metal e PCR

Um cofactor essencial para o polymerase do DNA em PCR é cloreto do magnésio.  Sua concentração deve optimized para cada sistema de primer:template. Muitos componentes da reação ligam o íon do magnésio, including primers, molde, produtos de PCR e dNTPs. O agente obrigatório de 1:1 principal para o íon do magnésio é a concentração elevada dos dNTPs na reação. Porque é necessário que o íon livre do magnésio sirva como um cofactor do enzyme em PCR, a concentração total do íon do magnésio deve exceder a concentração total do dNTP. Tipicamente, para começar o processo do optimization, 1.5 milímetro de cloreto do magnésio é adicionado a PCR na presença de dNTPs totais de 0.8 milímetro. Isto deixa aproximadamente 0.7 milímetro de magnésio livre para o polymerase do DNA. No general, o íon do magnésio deve ser variado em uma série da concentração de 1.5–4.0 milímetros em etapas de 0.5 milímetro.

Carcaças e analogs da carcaça para PCR

Os polymerases do DNA incorporam muito eficientemente dNTPs.  Também podem incorporar carcaças modificadas, quando são usados como componentes suplementares em PCR. Os exemplos das carcaças usadas para o polymerase do DNA são: Digoxigenin-dUTP, biotin-11-dUTP, dUTP, c7deaza-dGTP, e dNTPs fluorescently etiquetados. Para PCR convencional, a concentração do remains dos dNTPs balançada nas relações equimolar, por exemplo, 200 μM que cada dNTP. anota também aquele, desvios destas recomendações padrão pode ser benéfica em determinados amplications. Para o exemplo, quando o mutagenesis aleatório de um alvo específico é desejado, as concentrações desequilibradas do dNTP promovem um grau mais elevado de misincorporations pelo polymerase do DNA.

Amortecedores e sais para PCR

Dependendo do DNA o polymerase usou a concentração optimal do amortecedor de PCR, concentração de sal, e o pH deve ser escolhido conformemente ao polymerase do DNA. O amortecedor de PCR para o polymerase do DNA de Taq consiste em 50 milímetros de kCl e em 10 milímetros Tris-HCl, pH 8.3, na temperatura de quarto. Este amortecedor fornece a força ionic e a capacidade de buffering necessitadas durante a reação. É importante anotar que a concentração de sal afeta o Tm do duplex de primer:template, e daqui a temperatura do recozimento.

Cosolvents

PCR diferentes Cosolvents são usados aumentar o rendimento, o efficacy, e o specificity de amplifications de PCR. Estes cosolvents podem ser vantajosos em alguns amplifications, e desvantajosos em outros amplifications. É impossível predizer que que aditivo será útil para cada duplex de primer:template e conseqüentemente o cosolvent deve empìrica ser testado para cada combinação.

Considerações Dando um ciclo Térmicas

Embarcações de PCR

PCR deve ser executado nas embarcações que são compatíveis com quantidades baixas de enzyme e de ácidos nucleic e que têm características térmicas boas de transferência. Geralmente, o polypropylene é usado para embarcações de PCR e os tubos convencionais, thick-walled do microcentrifuge são escolhidos para muitos sistemas térmicos do cycler. PCR o mais frequentemente é executado em uns 10–100 μlitros escala da reação e requer a prevenção dos processos de evaporation/condensation no tubo closed da reação durante dar um ciclo térmico. Uma camada da folha de prova ou da cera do óleo mineral serve a esta finalidade. Mais recentemente, as embarcações 0.2-mL thin-walled optimized para o processo de PCR e os cyclers térmicos oil-free foram projetados que usam uma tampa aquecida sobre os tubos prendidos dentro do bloco da amostra.

Optimization do tempo da temperatura e de ciclo

É essencial que as misturas de reação alcançam o denaturation, o recozimento, e as temperaturas da extensão em cada ciclo térmico. Se o tempo de preensão insuficiente for especificado em qualquer temperatura, a temperatura da amostra não equilibrated com a aquela do bloco da amostra. Algum cycler térmico projeta o tempo onde o intervalo da preensão baseou na temperatura do bloco, visto que outro baseia o tempo de preensão na temperatura predita da amostra. Se um tubo thick-walled convencional usado em um cycler controlado pela temperatura do bloco, uma estadia de preensão 60-s for suficiente para o equilibration. A hora extra pode ser recomendada na etapa da extensão (72°C) para uns produtos mais longos de PCR. Usando um tubo 0.2-mL thin-walled em um cycler controlado pela temperatura predita da amostra, somente 15 s são requeridos. Para usar protocolos existentes ou aos protocolos do desenvolvimento para o uso em laboratórios múltiplos, é muito importante escolher tempos de preensão de acordo com a espessura de parede do projeto e do tubo do cycler.

Número Do Ciclo Do Amplification de PCR

O número de ciclos do amplification de PCR deve optimized com respeito à concentração começando do DNA do alvo. Recomenda-se que, de 40– 45 ciclos amplificar 50 moléculas do alvo, e de 25–30 ciclos para amplificar 3 × 105 moléculas à mesma concentração. Este non-non-proportionality é causado por um efeito so-called do platô, em que uma diminuição na taxa exponencial da acumulação do produto ocorre em estágios atrasados de um PCR. Isto pode ser causado pela degradação dos reactants (dNTPs, enzyme); depletion do reactant (primers, dNTPs); inibição do end-product (formação do pyrophosphate); competição para reactants por produtos non-specific; ou competição para o primer que liga reannealing (10 nM) do produto concentrado. É geralmente aconselhável funcionar o número mínimo dos ciclos necessitados ver o produto específico desejado, porque os produtos nonspecific não desejados interferirão se o número dos ciclos for excessivo.

 Enzyme/Alvo

Em um aliquot padrão do polymerase do DNA de Taq usado para uns 100-μlitros reação, há aproximadamente 1010 moléculas. Cada amostra de PCR deve ser avaliada para o número de cópias que do alvo contem ou pode conter. Para o exemplo, 1 ng do DNA do lambda contem 1.8 × 107 cópias. Para o número PCR da cópia da baixo-entrada, o enzyme torna-se limitando e pode ser necessário dar incremental ao processo da extensão mais tempo. Os cyclers térmicos podem confiantemente executar este procedimento automático da extensão do segmento a fim maximize o rendimento de PCR.

Condições Do Começo Quente

Todos os optimizations acima se aplicam também a um PCR que seja projetado, do começo, com um método do começo quente. Frequentemente, um começo quente pode ser incorporado com sucesso em um PCR previamente optimized sem mudar as condições da reação. Entretanto, paga geralmente reoptimize após ter adicionado um começo quente. O optimization é frequentemente um contrapeso entre produzir tanto produto como possível e overproducing nonspecific, amplifications do fundo. Porque o começo quente reduz extremamente amplifications do fundo, os restraints superiores são levantados em condições tais como a concentração do enzyme, dão um ciclo o número, e a concentração do cofactor do íon do metal. PCRs sensível que foi ajustado altamente sem um começo quente pode falhar quando um começo quente é adicionado. Isto pode ser causado por ligeiro atrasa nos ciclos adiantados causados misturar ou por ativação do enzyme. O PCR geralmente pode ser restaurado, frequentemente com aumento substancial no produto específico, simplesmente aumentando limitando parâmetros ou reagents. Além, há uns optimizations específicos a cada método do começo quente. Misturar ou ativação do enzyme podem ser afetadas pelo volume de PCR, pela composição do amortecedor e pelo pH, cosolvents, circunstâncias dando um ciclo, e assim por diante. A literatura específica’do produto s, frequentemente uma inserção do produto, deve ser consultada para a informação nestas considerações.