Condições bem sucedidas do PCR

Parâmetros para o PCR bem sucedido

Você é tido problemas de conseguir um PCR bem sucedido?  Muitos fatores podem afetar seu resultado de seu PCR como: Cofactor do íon do metal, carcaça e Analogs da carcaça, amortecedores e sais e Cosolvents.  Considerações da ciclagem também térmica:  Embarcações do PCR, optimização da temperatura e do tempo, de amplificação do PCR ciclos, enzima/alvo e começo quente. 

Cofactor do íon do metal e PCR

Um cofactor essencial para o polymerase de ADN no PCR é cloreto do magnésio.  Sua concentração deve ser aperfeiçoada para cada primeira demão: sistema do molde. Muitos componentes do íon do magnésio do ligamento da reação, incluindo primeiras demão, molde, produtos do PCR e dNTPs. O agente obrigatório do 1:1 principal para o íon do magnésio é a concentração elevada de dNTPs na reação. Porque é necessário que o íon livre do magnésio sira como um cofactor da enzima no PCR, a concentração total do íon do magnésio deve exceder a concentração total do dNTP. Tipicamente, para começar o processo da optimização, 1.5 milímetros de cloreto do magnésio são adicionados ao PCR na presença dos dNTPs totais de 0.8 milímetros. Isto deixa aproximadamente 0.7 milímetros de magnésio livre para o polymerase de ADN. Geralmente, o íon do magnésio deve ser variado em uma série da concentração de 1.5-4.0 milímetros em etapas de 0.5 milímetros.

Carcaças e Analogs da carcaça para o PCR

Os polymerases de ADN incorporam muito eficientemente dNTPs.  Igualmente podem incorporar carcaças modificadas, quando são usados como componentes suplementares no PCR. Os exemplos das carcaças usadas para o polymerase de ADN são: Digoxigenin-dUTP, biotin-11-dUTP, dUTP, c7deaza-dGTP, e dNTPs fluorescente etiquetados. Para o PCR convencional, a concentração de dNTPs permanece equilibrada em relações equimolar, por exemplo, μM 200 cada dNTP. Igualmente anote isso, desvios destas recomendações padrão pode ser benéfico em determinados amplications. Por exemplo, quando o mutagenesis aleatório de um alvo específico é desejado, as concentrações desequilibradas do dNTP promovem um grau mais elevado de misincorporations pelo polymerase de ADN.

Amortecedores e sais para o PCR

Dependendo do polymerase de ADN usou a concentração óptima do amortecedor do PCR, concentração de sal, e o pH deve ser escolhido conformemente ao polymerase de ADN. O amortecedor do PCR para o polymerase de ADN de Taq consiste em 50 milímetros de KCl e em Tris-HCl de 10 milímetros, pH 8.3, na temperatura ambiente. Este amortecedor fornece a concentração iónica e a capacidade de protecção necessários durante a reação. É importante anotar que a concentração de sal afeta o TM da primeira demão: duplex do molde, e daqui a temperatura do recozimento.

Cosolvents

O PCR diferente Cosolvents é usado para aumentar o rendimento, a eficácia, e a especificidade de amplificações do PCR. Estes cosolvents podem ser vantajosos em algumas amplificações, e desvantajosos em outras amplificações. É impossível prever que aditivo será útil para cada primeira demão: o duplex do molde e conseqüentemente o cosolvent deve empìrica ser testado para cada combinação.

Considerações da ciclagem térmica

Embarcações do PCR

O PCR deve ser executado nas embarcações que são compatíveis com baixas quantidades de enzima e de ácidos nucleicos e que têm boas características de transferência térmicas. Geralmente, o polypropylene é usado para embarcações do PCR e os tubos convencionais, thick-walled do microcentrifuge são escolhidos para muitos sistemas térmicos do cycler. O PCR o mais frequentemente é executado em uma escala da reação do μL 10-100 e exige a prevenção dos processos da evaporação/condensação no tubo fechado da reação durante a ciclagem térmica. Uma camada de óleo mineral da folha de prova ou da cera sere esta finalidade. Mais recentemente, as embarcações 0.2-mL thin-walled foram aperfeiçoadas para o processo do PCR e os cyclers térmicos oil-free foram projetados que usam uma tampa heated sobre os tubos prendidos dentro do bloco da amostra.

Optimização do tempo da temperatura e de ciclo

É essencial que as misturas de reação alcangam a desnaturação, o recozimento, e as temperaturas da extensão em cada ciclo térmico. Se o insuficiente tempo de preensão é especific em qualquer temperatura, a temperatura da amostra não estara com a aquela do bloco da amostra. Algum cycler térmico projetado o tempo onde o intervalo da preensão baseou na temperatura do bloco, visto que outro baseia o tempo de preensão na temperatura prevista da amostra. Se um tubo thick-walled convencional usado em um cycler controlado pela temperatura do bloco, uma estadia de preensão de 60 s é suficiente para a equilibração. O tempo adicional pode ser recomendado no (72°C) etapa da extensão para produtos mais longos do PCR. Usando um tubo 0.2-mL thin-walled em um cycler controlado pela temperatura prevista da amostra, somente 15 s são exigidos. Para usar protocolos existentes ou aos protocolos do desenvolvimento para o uso em laboratórios múltiplos, é muito importante escolher tempos de preensão de acordo com a espessura de parede do projeto e do tubo do cycler.

Número de ciclo da amplificação do PCR

O número de ciclos da amplificação do PCR deve ser aperfeiçoado no que diz respeito à concentração começando do ADN do alvo. Recomenda-se que, de 40 - 45 ciclos para amplificar 50 moléculas do alvo, e 25-30 dão um ciclo para amplificar 3 moléculas do × 105 à mesma concentração. Esta não-proporcionalidade é causada por um efeito assim chamado do platô, em que uma diminuição na taxa exponencial de acumulação do produto ocorre em estágios atrasados de um PCR. Isto pode ser causado pela degradação dos reagentes (dNTPs, enzima); prostração do reagente (primeiras demão, dNTPs); inibição do produto final (formação do pirofosfato); competição para reagentes por produtos não específicos; ou competição para a primeira demão que liga reannealing (10 nanômetro) do produto concentrado. É geralmente aconselhável funcionar o número mínimo de ciclos necessários para ver o produto específico desejado, porque os produtos não específicos não desejados interferirão se o número de ciclos é excessivo.

 Enzima/alvo

Em uma parte alíquota padrão do polymerase de ADN de Taq usado para uma reação de 100 μL, há aproximadamente 1010 moléculas. Cada amostra do PCR deve ser avaliada para o número de cópias que do alvo contem ou pode conter. Por exemplo, 1 ng do ADN do lambda contem 1.8 cópias do × 107. Para o PCR do número de cópia da baixo-entrada, a enzima torna-se de limitação e pode ser necessário dar incremental ao processo da extensão mais tempo. Os cyclers térmicos podem confiantemente executar este procedimento automático da extensão do segmento a fim maximizar o rendimento do PCR.

Condições do começo quente

Todas as optimizações acima igualmente aplicam-se a um PCR que seja projetado, do começo, com um método do começo quente. Frequentemente, um começo quente pode ser incorporado com sucesso em um PCR previamente aperfeiçoado sem mudar as condições da reação. Entretanto, paga geralmente para reoptimize após ter adicionado um começo quente. A optimização é frequentemente um contrapeso entre a produção de tanto produto como possível e overproducing não específico, amplificações do fundo. Porque o começo quente reduz extremamente amplificações do fundo, as limitações superiores são levantadas em condições tais como a concentração da enzima, o número de ciclo, e a concentração do cofactor do íon do metal. PCRs sensível que foi ajustado altamente sem um começo quente pode falhar quando um começo quente é adicionado. Isto pode ser causado por atrasos ligeiros nos ciclos adiantados causados pela mistura ou pela ativação da enzima. O PCR geralmente pode ser restaurado, frequentemente com aumento substancial no produto específico, simplesmente aumentando limitando parâmetros ou reagentes. Além, há umas optimizações específicas a cada método do começo quente. A mistura ou a ativação da enzima podem ser afetadas pelo volume do PCR, pela composição do amortecedor e pelo pH, cosolvents, circunstâncias de ciclagem, e assim por diante. A literatura do produto específico, frequentemente uma inserção do produto, deve ser consultada para a informação nestas considerações.