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PCR Baseou O Mutagenesis Dirigido Local

Mutagenesis Do Local Da Reação Chain Do Polymerase

Aprenda sobre o mutagenesis dirigido local baseado PCR.

(consulte ao diagrama abaixo)

Comece primeiramente com um plasmid que contem um gene com um codon do tyrosine do TAC que nós queiramos alterar a um codon do phenylalanine de TTC. A fim realizar isto que nós necessitamos mudar no par (azul) no original a um par de Ta. Este plasmid foi isolado de uma tensão normal de E.coli que methylates como de seqüências de GATC. Os grupos methyl são indicados no amarelo. As seguintes etapas são executadas para realizar esta:

• Aqueça o plasmid para separar suas costas.
• Nós recozemos então os primers mutagenic que contêm o codon de TTC, ou seu complemento reverso, GAA. A base alterada em cada primer é indicada na cor-de-rosa.
• Nós executamos então alguns círculos de PCR (aproximadamente 8) com os primers mutagenic para amplificar o plasmid com o codon alterado. Nós usamos um polymerase estável do DNA do calor, tal como o polymerase de Pfu, minimizar erros em copí o plasmid.
• Nós tratamos então o DNA na reação de PCR com o DpnI para digerir o selvagem-tipo methylated DNA. Desde que o produto de PCR foi feito em vitro, não methylated e não é cortado. Última nós transformamos pilhas do E. coli com o DNA tratado. No princípio, somente o DNA mutated sobrevive para transformar. Isto é verificado arranjando em seqüência o DNA do plasmid de diversos clones.



Fatores para um PCR bem sucedido

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ajude por favor à informação me-básica sobre o mutagenesis local-dirigido PCR trypsin	05-01-2008 06:21 PM por kmunson779 "	1	147
mutagenesis dirigido local usando Invitrogen Genetailor satishreddy27	06-19-2007 03:34 PM por satishreddy27 "	0	533

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Guia de pesquisa de defeitos de PCR hi todos, nós estamos tentando setup uma guia de pesquisa de defeitos de PCR. Ajude por favor pelos problemas comuns afixando e pelas suas soluções aqui thanks:notworthy:
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