Polymerases do PCR

Escolhendo o polymerase de ADN direito é determinado pelos alvos da experiência. Há uma quantidade vasta de anzymes disponíveis no comércio a escolher do esse difere em seus processivity, estabilidade térmica e fidelidade. A enzima a mais comum usada é polymerase de ADN de Taq igualmente conhecido tão comercialmente quanto, polymerase de ADN de AmpliTaq®.

Polymerase de ADN de AmpliTaq

O Polymerase de ADN de AmpliTaq é uma enzima de recombinação altamente caracterizada para o PCR. Produzido em Escherichia Coli do gene do polymerase de ADN de Taq, assim assegurando a grande pureza. Geralmente é fornecida e usada como uma solução de 5 U/μL em 50% protegido (v/v) glicerol.

Properities físico: A enzima é uma proteína do kDa 94 com uma atividade da polimerização 5 ' - 3 ' que seja a mais eficiente na escala 70°-80°C. É incredibly thermostable, com um half-life em 95°C de 35-40 Min. Nos termos da ciclagem térmica, o half-life é aproximadamente 100 ciclos. Os produtos do PCR que usam esta enzima terão únicas saliências baixas nas 3 ' extremidades de cada costa polimerizada (este pode ser explorado para o uso com vetores do clonagem de T/A).

Bio reações: O polymerase de ADN exige o íon do magnésio como um cofactor e catalisa a reação da extensão de um molde aprontado em 72°C. Os quatro dNTPs são usados para estender a primeira demão e therby para copiar a seqüência do alvo. Os nucleotides igualmente modificados podem ser incorporados em produtos do PCR.

Atividades: Esta enzima tem a forquilha-como o dependente da estrutura, polimerização realçada, atividade da nuclease 5 ' - 3 '. A atividade que possui permite-a que o ti degrada primeiras demão a jusante e indicou que os alvos do circuka devem ser tornados linear antes da amplificação. Esta atividade da nuclease foi empregada igualmente em uma técnica degeração fluorescente para a quantificação do PCR. Esta enzima não tem atividades inerente do exonuclease umas 3 ' - 5 ' ou da correcção, mas produz amplicons do rendimento elevado para a maioria de aplicações.

Polymerase do ouro de AmpliTaq

Esta enzima é um polymerase de ADN quimicamente modificado de AmpliTaq, a modificação reversível mantem a enzima inativa na temperatura ambiente. O pH de alta temperatura e baixo promove a reversão, restaurando a atividade de enzima. Estas circunstâncias ocorrem em um PCR Tris-protegido em 92°-95°C (o Tris-Cl formulou ao pH 8.3 nas gotas 25°C abaixo do pH 7.0 acima de 90°C). O ouro de AmpliTaq é formulado para executar o mesmos que o polymerase de ADN de 5 U/μL AmpliTaq. Conseqüentemente, um começo quente pode ser adicionado á maioria de PCRs aperfeiçoado com o polymerase de ADN de AmpliTaq substituindo o ouro de AmpliTaq e adicionando 10 um minuto, 95°C, pre-PCR, etapa da ativação.

Os mesmos resultados podem ser conseguidos sem a etapa da ativação pre-PCR adicionando 10 adicionais ou mais ciclos do PCR. Sob estas circunstâncias, a enzima é ativada incremental durante as etapas da desnaturação do PCR.

Igualmente veja Polymerases do PCR um artigo excelente na estação do PCR.