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Análise de produtos de PCR

Análise do electrophoresis do gel do agarose de produtos de PCR

A rapidamente e fàcilmente analise e resolva produtos de PCR, um 3% NuSieve pode ser o agarose usado de GTG (FMC Bioproducts, Rockland, MIM) e o gel do agarose de 1% Seakem GTG (FMC Bioproducts) funcionado em TBE (Tris-borato de 89 milímetros, EDTA de 2 milímetros) ou em TAE (40 milímetros de Tris-acetato, EDTA de 2 milímetros, pH approx 8.5). As faixas resolvidas do DNA são detectadas manchando os gels com o approx 0.5 μg/mL do brometo de ethidium, seguidas destaining com água ou o verde® 1 de SYBR (Molecular Sondar Inc., Eugene, OU) e fotografadas finalmente sob a iluminação UV. Use (kbp) uma escada 123-basepair (bp) ou 1-kilobasepair como um marcador conveniente para estimativas do tamanho dos produtos.

Outros métodos analíticos para analisar produtos de PCR

Há uma variedade de outros métodos de deteção disponíveis para a análise de produto de PCR, tal como o ethidium brometo-manchou 8–gels de polyacrylamide de 10% funcionados no amortecedor de TBE, gels do sul ou dot/blots, subcloning e arranjar em seqüência direto, análise do HPLC, e o uso dos microplates 96-well, nomear alguns. O reversos ponto-borram o amplification das ligas PCR do método com deteção nonradioactive. A introdução de tinturas fluorescentes a PCR, junto com um instrumento apropriado para a quantificação real-time, em linha de produtos de PCR durante o amplification conduziu ao desenvolvimento de PCR cinético ou de PCR quantitative. PCR quantitative (QPC) mede a acumulação do produto de PCR durante a fase exponencial da reação e antes que o amplification se tornar vulnerável, isto é, quando os reagents se tornarem limitados. O prisma 7700 de ABI (biosystems aplicados) e o LightCycler (biochemicals molecular de Roche, Mannheim, Germany) são os dispositivos fluorescentes integrados da deteção que permitem o fluorescence que monitora ou continuamente ou uma vez por o ciclo. Estes instrumentos podem também caracterizar produtos de PCR por suas características de derretimento, por exemplo, para discriminar mutations do singlebase de um selvagem-tipo seqüência. O sistema quantitative multiplex™ recentemente projetado de Mx4000 PCR (Strategene, la Jolla, CA) pode gerar e analisar dados para assays fluorescentes múltiplos do real-time QPCR.