Expressão de recombinação da proteína

Quando você quer caracterizar um gene ou uma proteína do interesse, você deve primeiramente estudar sua função. Nesta era molecular, obter um cDNA de seu gene do interesse não é difícil.

Para expressar o cDNA como uma proteína, IE. uma proteína de recombinação, uma pode então facilmente executar estudos funcionais usando a proteína purified de recombinação.

Uma vez que você tem uma proteína purified você pode conduzir:

experiências da interação da Proteína-proteína
Cinética da enzima
Estudos funcionais da proteína
Estudos estruturais - incluindo a cristalização da proteína, a estrutura da proteína e o NMR.
Você pode igualmente usar a proteína para fazer anticorpos para umas experiências mais adicionais.

Há dois sistemas principais para a expressão da proteína de recombinação. Uma vez que você começ seu cDNA clonado, você deve decidir onde você quer amplificar sua proteína. Este será (geralmente um sistema prokaryotic (bacteriano) ou eukaryotic do fermento ou da pilha mamífera). A escolha de seu sistema decidirá que vetor você precisará de clonar seu cDNA porque há os promotores diferentes que funcionam em Escherichia Coli e os outro que trabalham melhor com fermento ou sistemas mamíferos.

Assim que o sistema da expressão da proteína você usam-se?

Sistemas para a expressão da proteína

Sistemas Prokaryotic da expressão da proteína

Os sistemas de recombinação Prokaryotic da expressão da proteína têm diversas vantagens. Estes incluem a facilidade da cultura, e o significado que muito rápido do crescimento da pilha você não terá que esperar por muito tempo para começ a proteína dos sistemas bacterianos uma vez que você clona seu cDNA. A expressão pode ser induzida facilmente em sistemas bacterianos da expressão da proteína usando IPTG. Também, a purificação é completamente simples em sistemas prokaryotic da expressão e há uma pletora de jogos comerciais disponíveis para a expressão de recombinação da proteína.

De um lado, se você precisa de usar suas proteínas para estudos funcionais ou enzymatic os sistemas prokaryotic são um problema como a maioria de proteínas se tornam insolúveis em corpos de inclusão e são muito difíceis de recuperar como proteínas funcionais. Além disso, a maioria se não todas as modificações borne-translational não são adicionados pelas bactérias e conseqüentemente sua proteína do interesse não pode ser funcional. Os estudos Enzymatic assim podem ser unfruitful.

Sistemas Eukaryotic da expressão

Os genes Eukaryotic não estão realmente “em casa” em pilhas prokaryotic, mesmo quando são expressados sob o controle dos vetores prokaryotic. Uma razão é que as pilhas de Escherichia Coli freqüentemente reconhecem os produtos da proteína de genes eukaryotic clonados como estranhos e os destroem. Outro é que os prokaryotes não realizam os mesmos tipos da modificação do posttranslational como os eukaryotes fazem. Por exemplo, uma proteína que seja acoplada ordinariamente aos açúcares em uma pilha eukaryotic será expressada como uma proteína desencapada quando clonada nas bactérias. Isto pode efetuar a atividade ou a estabilidade de uma proteína, ou pelo menos a sua resposta aos anticorpos. Mais problema grave é que o interior de uma pilha bacteriana não é como conducente à dobradura apropriada de proteínas eukaryotic como o interior de uma pilha eukaryotic. Freqüentemente, o resultado é dobrado impropriamente, produtos inativos de genes clonados.

Os sistemas Eukaryotic para a expressão da proteína incluem:

fermento
pilhas mamíferas
pilhas do baculovirus (inseto)

Todos estes sistemas são grandes sistemas eukaryotic para a expressão de proteínas de recombinação.
As vantagens de sistemas eukaryotic da expressão da proteína incluem o fato de que você pode começ muito altos níeses da expressão. As proteínas são fáceis de purify usando os Tag especiais que são incluídos nos vetores que incluem seu, o Myc e os outros Tag.

Você pode mesmo comprar os plasmídeo que segregam sua proteína nos media. Conseqüentemente você pode manter-se crescer seu sistema e coletar os media sem lysing suas pilhas. Não há nenhum corpo de inclusão a preocupar-se aproximadamente e suas proteínas têm modificações borne-translational intatas. Estes são vitais se você está estudando a função de interações de uma proteína e/ou da proteína-proteína.

As desvantagens de sistemas eukaryotic da expressão da proteína incluem o fato de que as pilhas eukaryotic crescem mais lentas do que pilhas prokaryotic.

Vetores da expressão com promotores fortes

A função principal de um vetor da expressão é render geralmente o produto de um gene, mais o produto o melhor. Conseqüentemente, os vetores da expressão são equipados ordinariamente com os promotores muito fortes; a base racional é que mais mRNA é produzido, mais o produto da proteína estará feito.
Um tal promotor forte é o promotor do trp (operon do tryptophan). Dá forma à base para diversos vetores da expressão, incluindo ptrpL1. Tem uma região do promotor/operador do trp, seguida por um local obrigatório do ribosome, e pode ser usado diretamente como um vetor da expressão introduzindo um gene extrangeiro no local de ClaI. Alternativamente, a região de controle do trp pode ser feita a “portable” cortando o para fora com ClaI e HindIII e introduzindo o na frente de um gene a ser expressado em um outro vetor

Vetores Inducible da expressão

É geralmente vantajoso manter um gene clonado represed até que nós estejamos prontos para o expressar. Uma razão é que as proteínas eukaryotic produzidas em grandes quantidades nas bactérias podem ser tóxicas. Mesmo se estas proteínas não são realmente tóxicas, podem acumular-se aos grandes níveis de auch que interferem com o crescimento bacteriano. Em um ou outro caso, se o gene clonado foi permitido permanecer girado sobre constantemente, as bactérias que carregam o gene nunca viriam uma grande bastante concentração para produzir quantidades significativas de produto da proteína. A solução é manter o gene clonado desligado coloc o rio abaixo de um promotor inducible que possa ser desligado.
O promotor da laca é inducible até certo ponto, presumivelmente permanecendo fora até estimulado pelo isopropylthiogalactoside sintético do indutor (IPTG). Entretanto, a repressão causada pelo repressor da laca está incompleta, e alguma expressão do gene clonado será observada mesmo na ausência de indutor. O one-way em torno deste problema é expressar nosso gene em um plasmídeo ou em um phagemid que carreg seu próprio gene do lacI, como o pBS faz. O repressor adicional produzido por tal vetor mantem nosso gene clonado desligado até que nós estejamos prontos para o induzir com IPTG.
Uma outra estratégia é usar um promotor firmemente controlado como o promotor PL do fago do λ. Os vetores da expressão com este sistema do promotor/operador são clonados nas pilhas de anfitrião que carregam um gene sensível à temperatura do repressor do λ (c1857). Enquanto nós mantemos a temperatura destas pilhas relativamente baixa (32°C), o repressor funcionam, e nenhuma expressão ocorre. Entretanto, quando nós levantamos a temperatura para o nível nonpermissive (42ºC), o repressor sensível à temperatura pode já não funcionar e o gene clonado é induzido.

Vetores da expressão que produzem proteínas da fusão

Quando a maioria de vetores da expressão se operam, produzem proteínas da fusão. Esta pôde no início parecer uma desvantagem porque o produto natural do gene introduzido não é feito. Entretanto, os ácidos aminados extra na proteína da fusão podem ser uma grande ajuda em purifying o produto da proteína.

Considere os vetores da expressão do oligo-histidine, um de que tem os pTrcHis do nome de comércio. Estes têm uma seqüência curta apenas rio acima do local múltiplo do clonagem que codifica um estiramento de seis histidines. Assim, uma proteína expressada em tal vetor será uma proteína da fusão com seis histidines em sua amino extremidade. Por que nós quereríamos anexar seis histidines a nossa proteína? as regiões do Oligo-histidine como esta têm uma afinidade elevada para metais como niquelar, assim que nós podemos purify as proteínas que têm tais regiões usando a cromatografia de afinidade niquelar. A beleza deste método está a suas simplicidade e velocidade. Depois que as bactérias fizeram a proteína da fusão, nós lyse simplesmente as, adicionamos o extrato bacteriano do srude a uma coluna de afinidade niquelar, lavamos para fora todas as proteínas unbound, a seguir liberamos a proteína da fusão com histidine ou um imidazole chamado análogo do histidine. Este procedimento permite que nós colham essencialmente a fusão pura em somente uma etapa. Isto é possível porque muito pouco se alguma proteína natural tem regiões do oligo-histidine, assim que nossa proteína da fusão são essencialmente único que liga à coluna.

Que se nós queremos nossa proteína - livram do Tag do oligo-histidine?

Os desenhadores destes vetores forneceram pensativamente uma maneira de removê-la. Imediatamente antes do local múltiplo do clonagem, há uma região da codificação para um estiramento dos ácidos aminados reconhecidos pelo enterokinase da enzima proteolytic. Assim nós podemos usar o enterokinase para fender a proteína da fusão em duas porções: o Tag do oligo-histidine e a proteína que nós queremos. O local reconhecido pelo enterokinase é muito raro, e a possibilidade que existe em nossa proteína é insignificanta. Assim, nossa proteína não deve ser desbastada acima de enquanto nós estamos removendo seu Tag do oligo-histidine. Se nós queremos, nós podemos funcionar a proteína enterokinase-fendida através da coluna niquelar uma vez mais para separar os fragmentos oligo-hisitidine da proteína do interesse.

os fago do λ igualmente seriram como a base para vetores da expressão; um projetado é especificamente com esta finalidade λgt11. Este fago contem uma região de controle da laca seguida pelo gene do lacZ. Os locais do clonagem são ficados situados dentro do gene do lacZ, assim que os produtos de um gene introduzido neste vetor serão proteínas da fusão com um líder da B-galactosidase.
O vetor λgt11 da expressão transformou-se um veículo popular para fazer e selecionar bibliotecas do cDNA. λgt11 permite que nós selecionem um grupo de clone diretamente para a expressão da proteína direita. Os ingredientes principais exigidos para este procedimento são biblioteca do cDNA em λgt11 e um anti-soro dirigido de encontro à proteína do interesse.
Nós chapeamos nossos fago do λ com as várias inserções do cDNA e borramos as proteínas liberadas por cada clone em uma sustentação tal como a nitrocelulose. Uma vez que nós transferimos as proteínas de cada chapa à nitrocelulose, nós sondamos com nosso anti-soro. Em seguida, nós procuramos o anticorpo limitado à proteína de uma chapa particular, usando a proteína etiquetada A do staphylococcus - áureo. Esta proteína liga firmemente ao anticorpo e etiqueta o ponto correspondente na nitrocelulose. Nós detectamos esta etiqueta pela autoradiografia ou phosphorimaging, a seguir vamos a nossa placa mestra e escolhemos a chapa correspondente. Anote que nós estão detectando uma proteína da fusão, não a proteína do interesse própria. Além disso, não importa se nós clonamos um cDNA inteiro ou não. Nosso anti-soro é uma mistura dos anticorpos que reagirão com diversas partes diferentes de nossa proteína, tão mesmo um gene parcial fará, enquanto sua região da codificação é clonada no mesmo frame da orientação e de leitura que a região da codificação da B-galactosidase.

Para uma revisão de recombinação rápida da expressão da proteína veja:

Sistemas de recombinação da proteína