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Expressão Recombinant Da Proteína

Estação © Molecular 2006 Do Copyright

Quando você quer caracterizar um gene ou uma proteína do interesse, você deve primeiramente estudar sua função. Nesta era molecular, obter um DNA de seu gene do interesse não é difícil.

Para expressar o DNA como uma proteína, o IE uma proteína recombinant, uma pode então fàcilmente executar estudos funcionais usando a proteína purified recombinant.

Uma vez que você tem uma proteína purified você pode conduzir:

• Experiências Da Interação Da Proteína-proteína
• Kinetics Do Enzyme
• Estudos funcionais da proteína
• Estudos estruturais - including a cristalização da proteína, a estrutura da proteína e o NMR.
• Você pode também usar a proteína fazer antibodies para umas experiências mais adicionais.

Há dois sistemas principais para a expressão da proteína recombinant. Uma vez que você começa seu DNA cloned, você deve decidir-se onde você quer amplificar sua proteína. Este será (geralmente um sistema prokaryotic (bacteriano) ou eukaryotic do fermento ou da pilha mammalian). A escolha de seu sistema decidir-se-á que vetor você necessitará clone seu DNA porque há os promoters diferentes que funcionam em E.Coli e os outros que trabalham melhor com fermento ou sistemas mammalian.

Assim que o sistema da expressão da proteína você usam-se?

 Sistemas para a expressão da proteína

Sistemas Da Expressão Da Proteína De Prokaryotic

Os sistemas recombinant da expressão da proteína de Prokaryotic têm diversas vantagens. Estes incluem a facilidade da cultura, e o meaning que muito rápido do crescimento da pilha você não terá que esperar por muito tempo para começar a proteína dos sistemas bacterianos uma vez que você clone seu DNA. A expressão pode ser induzida fàcilmente em sistemas bacterianos da expressão da proteína usando IPTG. Também, o purification é completamente simples em sistemas prokaryotic da expressão e há um plethora dos jogos comerciais disponíveis para a expressão recombinant da proteína.

Na outra mão, se você necessitar usar suas proteínas para estudos funcionais ou enzymatic os sistemas prokaryotic são um problema enquanto a maioria de proteínas se tornam insoluble em corpos do inclusion e são muito difíceis de recuperar como proteínas funcionais. Além disso, a maioria if.not todas as modificações borne-post-translational não são adicionados pelas bactérias e conseqüentemente sua proteína do interesse não pode ser funcional. Os estudos enzymatic assim podem ser unfruitful.

Sistemas Da Expressão De Eukaryotic

Os genes de Eukaryotic não estão realmente “na HOME” em pilhas prokaryotic, mesmo quando são expressados sob o controle dos vetores prokaryotic.  Uma razão é que as pilhas do E. coli freqüentemente reconhecem os produtos da proteína de genes eukaryotic cloned como outsiders e os destroem.  Outro é que os prokaryotes não realizam os mesmos tipos da modificação do posttranslational como os eukaryotes .  Para o exemplo, uma proteína que seja acoplada ordinariamente aos açúcares em uma pilha eukaryotic será expressada como uma proteína desencapada quando cloned nas bactérias.  Isto pode efetuar uma atividade’ou uma estabilidade da proteína s, ou ao menos sua resposta aos antibodies.  Um problema mais sério é que o interior de uma pilha bacteriana não é como conducive à dobradura apropriada de proteínas eukaryotic como o interior de uma pilha eukaryotic.  Freqüentemente, o resultado é dobrado impropriamente, produtos inativos de genes cloned. 

Os sistemas de Eukaryotic para a expressão da proteína incluem:

• fermento
• pilhas mammalian
• pilhas do baculovirus (inseto)

Todos estes sistemas são sistemas eukaryotic grandes para a expressão de proteínas recombinant.
As vantagens de sistemas eukaryotic da expressão da proteína incluem o fato que você pode começar níveis muito elevados da expressão. As proteínas são fáceis de purify usando os Tag especiais que são incluídos nos vetores including his, o Myc e os outros Tag.

Você pode mesmo comprar os plasmids que secrete sua proteína nos media. Conseqüentemente você pode manter-se crescer seu sistema e coletar os media sem lysing suas pilhas. Não há nenhum corpo do inclusion a preocupar-se aproximadamente e suas proteínas têm modificações borne-post-translational intatas. Estes são vitais se você estiver estudando a função de interações de uma proteína e/ou da proteína-proteína.

As desvantagens de sistemas eukaryotic da expressão da proteína incluem o fato que as pilhas eukaryotic crescem mais lentas do que pilhas prokaryotic.

Vetores da expressão com promoters fortes

A função principal de um vetor da expressão é render geralmente o produto de um gene-, mais o produto o melhor.  Conseqüentemente, os vetores da expressão são equipados ordinariamente com os promoters muito fortes; o rationale é que mais mRNA é produzido, mais o produto da proteína estará feito.
Um tal promoter forte é o promoter do trp (operon do tryptophan).  Dá forma à base para diversos vetores da expressão, including ptrpL1.  Tem uma região do trp promoter/operator, seguida por um local obrigatório do ribosome, e pode ser usado diretamente como um vetor da expressão introduzindo um gene extrangeiro no local de ClaI. Alternativamente, a região do controle do trp pode ser feita “portátil” cortando o para fora com ClaI e HindIII e introduzindo o na frente de um gene a ser expressado em um outro vetor

Vetores Inducible Da Expressão

É geralmente vantajoso manter um gene cloned represed até que nós estejamos prontos para o expressar.  Uma razão é que as proteínas eukaryotic produzidas em quantidades grandes nas bactérias podem ser tóxicas.  Mesmo se estas proteínas não são realmente tóxicas, podem construir até níveis grandes de auch que interferem com o crescimento bacteriano.  Em um ou outro caso, se o gene cloned fosse permitido remanescer girado sobre constantemente, as bactérias que carregam o gene nunca viriam a uma concentração grande bastante para produzir quantidades significativas do produto da proteína.  A solução deve manter o gene cloned desligado colocando o rio abaixo de um promoter inducible que possa ser desligado.
O promoter do lac é inducible a alguma extensão, presumably restante fora até estimulado pelo isopropylthiogalactoside sintético do inducer (IPTG).  Entretanto, o repression causado pelo repressor do lac está incompleto, e alguma expressão do gene cloned será observada mesmo na ausência do inducer.  O one-way em torno deste problema deve expressar nosso gene em um plasmid ou em um phagemid que carregue seu próprio gene do lacI, como os pBS .  O repressor adicional produziu por tais sustentos de um vetor nosso gene cloned desligado até que nós estejamos prontos para o induzir com IPTG.
Uma outra estratégia é usar um promoter firmemente controlado como λ o promoter phage PL. Os vetores da expressão com este sistema de promoter/operator cloned nas pilhas de anfitrião que carregam um gene λ temperatura-sensível do repressor (c1857).  Tão por muito tempo como nós mantemos a temperatura destas pilhas relativamente baixa (32°C), o repressor funciona, e nenhuma expressão ocorre.  Entretanto, quando nós levantamos a temperatura para o nível nonpermissive (42ºC), o repressor temperatura-sensível não enlate nenhuma função mais longa e o gene cloned é induzido.

Vetores da expressão que produzem proteínas da fusão

Quando a maioria de vetores da expressão se operam, produzem proteínas da fusão.  Esta pôde no início parecer uma desvantagem porque o produto natural do gene introduzido não é feito.  Entretanto, os aminos-ácido extra na proteína da fusão podem ser uma ajuda grande em purifying o produto da proteína.

Considere os vetores da expressão do oligo-oligo-histidine, um de que tem os pTrcHis do nome de comércio.  Estes têm uma seqüência curta apenas rio acima do local múltiplo do cloning que codifica um estiramento de seis histidines.  Assim, uma proteína expressada em tal vetor será uma proteína da fusão com seis histidines em sua amino extremidade.  Por que nós quereríamos unir seis histidines a nossa proteína?  as regiões do Oligo-oligo-histidine como esta têm uma afinidade elevada para metais como niquelar, assim que nós podemos purify as proteínas que têm tais regiões usando o chromatography da afinidade niquelar.  A beleza deste método está a seus simplicity e velocidade.  Depois que as bactérias fizeram a proteína da fusão, nós lyse simplesmente as, adicionamos o extrato bacteriano do srude a uma coluna da afinidade niquelar, lavamos para fora todas as proteínas unbound, a seguir liberamos a proteína da fusão com histidine ou um imidazole chamado análogo do histidine.  Este procedimento permite que nós colham essencialmente a fusão pura em somente uma etapa.  Isto é possível porque muito pouco se alguma proteína natural tiver regiões do oligo-oligo-histidine, assim que nossa proteína da fusão são essencialmente único que liga à coluna.

Que se nós quisermos nossa proteína livre do Tag do oligo-oligo-histidine? 

Os desenhadores destes vetores forneceram pensativamente uma maneira removê-la.  Imediatamente antes do local múltiplo do cloning, há uma região do coding para um estiramento dos aminos-ácido reconhecidos pelo enterokinase proteolytic do enzyme.  Assim nós podemos usar o enterokinase cleave a proteína da fusão em duas porções:  o Tag do oligo-oligo-histidine e a proteína que nós queremos. O local reconhecido pelo enterokinase é muito raro, e a possibilidade que existe em nossa proteína é insignificanta.  Assim, nossa proteína não deve chopped acima de enquanto nós estamos removendo seu Tag do oligo-oligo-histidine.  Se nós quisermos, nós podemos funcionar a proteína enterokinase-enterokinase-cleaved através da coluna niquelar uma vez que mais para separar os fragmentos do oligo-hisitidine da proteína do interesse.

λ os phages serviram também como a base para vetores da expressão;  um projetado especificamente para esta finalidade é λgt11.  Este phage contem uma região do controle do lac seguida pelo gene do lacZ.  Os locais do cloning são ficados situados dentro do gene do lacZ, assim que os produtos de um gene introduzido neste vetor serão proteínas da fusão com um líder do B-b-galactosidase.
O vetor gt11 λda expressão transformou-se um veículo popular para fazer e selecionar bibliotecas do DNA.  λgt11 permite que nós selecionem um grupo de clones diretamente para a expressão da proteína direita.  Os ingredientes principais requeridos para este procedimento são biblioteca do DNA λem gt11 e um antiserum dirigido de encontro à proteína do interesse.
Nós chapeamos nossos λ phages com as várias inserções do DNA e borramos as proteínas liberadas por cada clone em uma sustentação tal como o nitrocellulose.  Uma vez que nós transferimos as proteínas de cada chapa ao nitrocellulose, nós sondamos com nosso antiserum.  Em seguida, nós procuramos o antibody limitado à proteína de uma chapa particular, usando a proteína etiquetada A do staphylococcus aureus.  Esta proteína liga firmemente ao antibody e etiqueta o ponto correspondente no nitrocellulose.  Nós detectamos esta etiqueta pelo autoradiography ou phosphorimaging, então vamos a nossa placa mestra e escolhemos a chapa correspondente.  Anote que nós estão detectando uma proteína da fusão, não a proteína do interesse própria.  Além disso, não importa se nós cloned um DNA inteiro ou não.  Nosso antiserum é uma mistura dos antibodies que reagirão com diversas partes diferentes de nossa proteína, assim mesmo um gene parcial fará, tão por muito tempo como sua região do coding cloned no mesmo frame da orientação e da leitura que a região do coding do B-b-galactosidase.

Para uma revisão recombinant rápida da expressão da proteína veja:

Sistemas Recombinant Da Proteína

Estação © Molecular 2006 Do Copyright