Hibridação da membrana para selecionar uma biblioteca

Bibliotecas da seleção usando a hibridação da membrana

Sob as circunstâncias da temperatura e da concentração do íon encontradas nas pilhas, o ADN é mantido em uma estrutura (dois-encalhada) frente e verso pelas ligações de hidrogênio que dão forma entre as bases de A e de T e bases de G e de C em cada costa. Os duplex do ADN podem ser desnaturados em únicas costas aquecendo as, geralmente em uma solução de sal diluída (por exemplo, NaCl de 0.01 M), ou levantando o pH acima de 11. Se a temperatura é abaixada e a concentração do íon na solução está levantada, ou se o pH está abaixado à reforma baixa dos pares da neutralidade, EM e do G-C entre únicas costas complementares.

Este processo vai por muitos nomes: renaturation, reassociação, hibridação, recozendo. Em uma mistura de ácidos nucleicos, somente as únicas costas complementares (ou as costas que contêm regiões complementares) reassociarão; a extensão de sua reassociação é virtualmente não afetada pela presença de costas noncomplementary. Tal hibridação molecular pode ocorrer entre duas costas complementares do ADN ou do RNA, ou entre uma costa do RNA e uma costa do ADN. Para utilizar a hibridação molecular na deteção de clone específicos do ADN, o único ADN encalhado das moléculas do ADN de recombinação é anexado a uma sustentação contínua, geralmente um filtro da nitrocelulose ou uma membrana de nylon tratada. Quando uma solução que contem ácidos nucleicos de single0stranded é secada em tal membrana, as únicas costas tornam-se limitadas irreversìvel à sustentação contínua em uma maneira que as folhas mais das bases disponíveis para a hibridação a uma costa complementar. Embora a química se este emperramento irreversível não é compreendida boa, o procedimento seja muito útil. A membrana é incubada então em uma solução que contem o ADN single-stranded radioativa etiquetado (ou o RNA) que é complementar a algum do ácido nucleico limitado à membrana.

Sob circunstâncias da hibridação (perto do pH neutro, 40-65 C, NaCl de 0.3-0.6 M), esta ponta de prova etiquetada cruza ao ácido nucleico complementar limitado à membrana. Toda a ponta de prova adicional que não cruzar é lavada afastado, e os híbrido etiquetados é detectada pela autoradiografia do filtro. Os virions de recombinação do lamda atuais nas chapas de um gramado de Escherichia Coli são transferidos a uma membrana de nylon coloc a membrana na superfície do prato de petri. Muitas das partículas virais em cada chapa absorvem à superfície da membrana, mas muitos virions permanecem nas chapas na superfície do ágar nutriente no prato de petri que contem um grande número clone individuais do lamda são reproduzidos na superfície da membrana.

O prato de petri do original refrigerated para armazenar a coleção de clone do lamda. A membrana é incubada então em uma solução alcalina, que interrompa os virions, liberando e desnaturando o ADN encapsulated. A membrana é secada então, reparando o ADN de recombinação do lamda à superfície da membrana. Em seguida, a membrana é incubada com uma ponta de prova radiolabeled sob circunstâncias da hibridação. A ponta de prova de Unhybridized é lavada afastado, e o filtro é sujeitado à autoradiografia.

A aparência de um ponto no autoradiogram indica a presença de um clone de recombinação do lamda que contem o ADN complementar à ponta de prova. A posição do ponto sobre o autoradiogram corresponde à posição sobre o prato de petri original onde esse clone particular deu forma a uma chapa. Desde que o prato de petri original ainda contem muitos virions do infectioua em cada chapa, as partículas virais do clone identificado podem ser recuperadas substituindo alinhando o autoradiogram e o prato de petri e removendo as partículas virais do clone que corresponde ao ponto. Uma técnica similar pode ser aplicada para selecionar uma biblioteca do plasmídeo em pilhas de Escherichia Coli.