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Hybridization da membrana para selecionar uma biblioteca

Bibliotecas da seleção usando o hybridization da membrana

Sob as condições da temperatura e do íon a concentração encontrou nas pilhas, o DNA é mantido em uma estrutura (dois-encalhada) frente e verso pelas ligações do hidrogênio que o formulário betwen as bases de A e de T e bases de G e de C em cada costa. Os duplex do DNA podem ser desnaturados em únicas costas aquecendo as, geralmente em uma solução de sal diluída (por exemplo, NaCl de 0.01 M), ou levantando o pH acima de 11. Se a temperatura for abaixada e a concentração do íon na solução está levantada, ou se o pH estiver abaixado à reforma baixa dos pares do neutrality, EM e do G-C entre únicas costas complementares.

Este processo vai por muitos nomes: renaturation, reassociação, hybridization, recozendo. Em uma mistura de ácidos nucleic, somente as únicas costas complementares (ou as costas que contêm regiões complementares) reassociarão; a extensão de sua reassociação é virtualmente não afetada pela presença de costas noncomplementary. Tal hybridization molecular pode ocorrer entre duas costas complementares do DNA ou do RNA, ou entre uma costa do RNA e uma costa do DNA. Utilizar o hybridization molecular na deteção do DNA específico clones, único DNA encalhado das moléculas recombinant do DNA é unida a uma sustentação contínua, geralmente um filtro do nitrocellulose ou uma membrana de nylon tratada. Quando uma solução que contem ácidos nucleic de single0stranded é secada em tal membrana, as únicas costas tornam-se limitadas irreversibly à sustentação contínua em uma maneira que as folhas mais das bases disponíveis para o hybridization a uma costa complementar. Embora o chemistry se este emperramento irreversible não for compreendida boa, o procedimento seja muito útil. A membrana incubated então em uma solução que contem o DNA único-encalhado radioativa etiquetado (ou o RNA) que é complementar a algum do ácido nucleic limitado à membrana.

Sob circunstâncias do hybridization (perto de pH neutro, 40-65 C, NaCl de 0.3-0.6 M), esta ponta de prova etiquetada hybridizes ao ácido nucleic complementar limitado à membrana. Toda a ponta de prova adicional que não hybridize é lavada afastado, e os híbrido etiquetados é detectada pelo autoradiography do filtro. Os virions recombinant do lamda atuais nas chapas de um gramado de E. coli são transferidos a uma membrana de nylon colocando a membrana na superfície do prato de petri. Muitas das partículas viral em cada chapa absorvem à superfície da membrana, mas muitos virions remanescem nas chapas na superfície do ágar nutriente no prato de petri que contem um grande número lamda individual clones são reproduzidos na superfície da membrana.

O prato de petri do original refrigerated para armazenar a coleção do lamda clones. A membrana incubated então em uma solução alcalina, que disrupts os virions, liberando e desnaturando o DNA encapsulated. A membrana é secada então, reparando o DNA recombinant do lamda à superfície da membrana. Em seguida, a membrana incubated com uma ponta de prova radiolabeled sob circunstâncias do hybridization. A ponta de prova de Unhybridized é lavada afastado, e o filtro é sujeitado ao autoradiography.

O appearence de um ponto no autoradiogram indica a presença de um clone recombinant do lamda que contem o DNA complementar à ponta de prova. A posição do ponto no autoradiogram corresponde à posição no prato de petri original onde esse clone particular deu forma a uma chapa. Desde que o prato de petri original contem ainda muitos virions do infectioua em cada chapa, as partículas viral do clone identificado podem ser recuperadas substituindo alinhando o autoradiogram e o prato de petri e removendo as partículas viral do clone que corresponde ao ponto. Uma técnica similar pode ser aplicada para selecionar uma biblioteca do plasmid em pilhas de E.coli.